响应面法优化南瓜籽中抗氧化物提取工艺

朱碧芬，闫加桐，程春生，覃宇悦

（昆明理工大学 农业与食品学院，云南 昆明 650550）

南瓜（Cucurbita moschata Duch.），别名番瓜、饭瓜等，是葫芦科一年生草本植物。南瓜籽就是成熟南瓜的种子，其产量在逐年上升，中国人食用南瓜籽的历史悠久。南瓜籽中富含南瓜多糖、活性蛋白质、多不饱和脂肪酸酸、维生素和矿物质等[1-3]。

生物体的生命活动会产生自由基，它们在生物体代谢、免疫、细胞信号传导等过程中都起着重要的作用[4]，但是过量自由基可攻击机体的细胞和组织，机体的衰老和许多慢性疾病都与自由基的氧化有关[5]。近年来，天然成分的抗氧化性倍受人们关注[6]，南瓜籽提取物因其抗氧化作用而具有研究价值。研究表明南瓜籽中的蛋白和多糖对DPPH自由基、羟自由基、超氧自由基有较好的清除效果[4，7]。此外，已经发现南瓜籽蛋白具有降糖活性从而可缓解糖尿病症[8]。

本研究以单因素试验和响应面法设计试验，对脱脂南瓜籽乙醇回流提取工艺进行优化，测定并研究所得提取物的抗氧化能力，为进一步开发南瓜籽中的抗氧化物提供科学依据。

1 材料与仪器

南瓜籽购于当地干果市场，60 ℃烘干，碾压破碎，过40目筛，塑封袋装好备用。福林酚试剂1 mol/L，1，1-二苯基-2三硝基苯肼（DPPH），纯度＞97%；三氯化铁，磷酸氢二钠，无水乙醇，铁氰化钾，磷酸二氢钠，无水碳酸钠，三氯乙酸，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

TU 1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；LXJ-IIB型离心机，上海安亭科技仪器厂；RE-52CS-2 旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，金坛市科析仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 南瓜籽提取物制备

南瓜籽脱脂干燥后，称取一定量南瓜籽粉末，抗氧化物的提取用回流法。3 500 r/min，离心10 min，静置，取上清液，蒸干溶剂，乙醇溶解定容至50 mL，得到抗氧化提取物[9]。4 ℃保存，备用。

2.2 提取率测定

采用恒重法原理测定。将提取物1 g置于50 ℃干燥箱的蒸发皿中，加热1 h，冷却0.5 h，称重，反复干燥至质量差不超过2 mg[10]。提取率计算公式为:式中，m2为恒重后蒸发皿和提取物质量，m1为蒸发皿重量，v为提取物总体积，m为南瓜籽干重。

2.3 单因素试验

2.3.1 考察乙醇浓度对南瓜籽提取率的影响

液料比20∶1 mL/g，提取时间120 min，提取温度80 ℃，不同乙醇浓度为（50%、60%、70%、80%、90%）[11]。

2.3.2 考察液料比对南瓜籽提取率的影响

乙醇浓度70%，提取时间120 min，提取温度80 ℃，不同液料比为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g[12]。

2.3.3 考察提取时间对南瓜籽提取率的影响

提取温度80 ℃，乙醇浓度70%，液料比20∶1 mL/g，不同提取时间为60、90、120、150、180 min[13]。

2.3.4 考察提取温度对南瓜籽提取率的影响

乙醇浓度70%，液料比20∶1 mL/g，提取时间120 min，不同提取温度为60、70、80、90、100 ℃[14]。

2.4 响应面法优化提取条件

根据单因素试验，最佳条件为：提取时间120 min，液料比20∶1 mL/g，乙醇70%，提取温度80 ℃。设计4因素3水平响应面试验。使用软件Design-Expert 8.0.6处理数据，根据响应面三维模型确定南瓜籽提取的最优条件[15-17]。

2.5 提取物抗氧化活性测定

2.5.1 清除DPPH自由基能力测定

DPPH自由基清除能力的测定参考相关文献[18]，抑制率计算公式为

式中，Ai是DPPH溶液2 mL加样品0.4 mL时的吸光度值，Aj是甲醇溶液2 mL加样品0.4 mL时的吸光度值，A0是甲醇溶液2 mL加超纯水0.4 mL时的吸光度值[19]。

2.5.2 还原能力测定

还原能力的测定参考文献[19-21]。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验

3.1.1 乙醇浓度对南瓜籽提取率的影响

提取条件为液料比20∶1 mL/g，提取时间120 min，提取温度80 ℃，乙醇浓度对南瓜籽提取率的影响如图1。南瓜籽提取率随乙醇浓度的增加先增大，随后略有下降，当乙醇浓度为70%时，提取率最高为15.63%。说明70%乙醇水溶液的极性与南瓜籽抗氧化提取物的极性最相似，从而使溶质的提取率最高，因此乙醇的最佳浓度为70%。

图1 乙醇浓度对南瓜籽提取率的影响Figure 1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of pumpkin seeds

3.1.2 液料比对南瓜籽提取率的影响

提取条件为乙醇70%，提取时间120 min，提取温度80 ℃，液料比对南瓜籽提取率的影响如图2。南瓜籽提取率随液料比的增加先增高后下降，当液料比为20∶1 mL/g时，提取率最高为15.36%。

液料比是影响传质的主要因素，随着液料比的增大，传质速率增大，南瓜籽中抗氧化物的提取率也不断增大，当液料比大于20∶1 mL/g时，提取率略有下降，且还会增加溶剂处理回收的时间，增加提取成本，故液料比最佳为20∶1 mL/g。

图2 液料比对南瓜籽提取率的影响Figure 2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of pumpkin seeds

3.1.3 提取时间对南瓜籽提取率的影响

提取条件为乙醇70%，液料比20∶1 mL/g，提取温度80 ℃，提取时间对南瓜籽提取率的影响如图3。南瓜籽提取率随提取时间的增加先增大后下降，当提取时间为120 min时，提取率最高为14.87%。随着提取时间的增大，南瓜籽中抗氧化物溶出的越多，但是时间过长会导致溶剂挥发，提取率会略有下降，因此提取时间120 min最佳。

图3 提取时间对南瓜籽提取率的影响Figure 3 Influence of extraction time on extraction rate of pumpkin seeds

3.1.4 提取温度对南瓜籽提取率的影响

提取条件为乙醇70%，液料比20∶1 mL/g，提取时间120 min，提取温度对南瓜籽提取率的影响如图4。南瓜籽提取率随提取温度的增加先增高后下降，当提取温度为80 ℃时，提取率最高为14.35%。这主要是因为温度决定溶质的热运动能力，随着温度的升高，溶质的提取率增大，但温度过高，溶质的稳定性变差，溶质分解导致提取率降低，因此提取温度80 ℃最佳。

图4 提取温度对南瓜籽提取率的影响Figure 4 Influence of extraction temperature on extraction rate of pumpkin seeds

3.2 响应面法优化提取工艺

在单因素试验的基础上，根据BBD中心组合试验设计原理，以提取率为考察指标（Y），乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）四个因素为自变量，设计4因素3水平试验确定南瓜籽的最佳提取工艺。因素水平见表1，试验设计和结果见表2，回归方程为Y=15.01+0.33*A+0.51*B+0.29*C+0.33*D-0.035*AB+0.012*AC-0.018*AD-0.005*BC+0.035*BD-0.46*A2-0.52*B2-0.36*C2-0.62*D2，方差分析见表3。

方差分析表中，模型P ＜0.0001，差异极显著，且R2=0.9899与R2adj=0.9933接近，说明该模型对南瓜籽提取率（Y）的拟合度好；失拟项=0.22，差异不显著，说明该模型可信度高。一次项A、B、C、D和二次项A2、B2、C2、D2的P均小于0.0001，说明它们对Y的影响极显著，但各因素之间的相互作用较弱（图5），一次项中对南瓜籽提取率的影响为C ＜D ＜A ＜B。

表1 Box-Behnken Design因素水平表Table 1 Box-Behnken Design factor level table

表2 Box-Behnken Design 试验设计和结果Table 2 Experimental Design and results of Box-Behnken Design

各因素对南瓜籽提取率影响的等高线图和响应曲面图见图5。利用Design-Expert8.0.6软件中的BBD响应面优化分析，得到南瓜籽提取物的最佳提取条件为：70%乙醇，液料比20∶1 mL/g，提取时间120 min，提取温度80 ℃。在最佳提取条件下，进行三次验证试验，南瓜籽的提取率为15.11%，与预测值15.008%接近，说明该模型可以较好地反应南瓜籽提取物的最佳提取条件。

3.3 抗氧化能力评估

3.3.1 提取物的DPPH自由基清除能力

通过测定吸光值的变化来评价南瓜籽提取物对DPPH自由基的清除效果，从而反映南瓜籽提取物的抗

氧化性强弱[22-24]。表4为南瓜籽不同提取率对DPPH自由基清除能力的测定结果。随着提取物率的增加，其清除DPPH的能力呈上升趋势，当南瓜籽提取率为15.63%时，对DPPH自由基的抑制率达87.28%。

表3 响应面二次模型的方差分析表Table 3 Analysis of variance of quadratic model of response surface

图5 各因素对南瓜籽提取率影响的响应面曲线图Figure 5 Response surface curves of various factors influencing the extraction rate of pumpkin seeds

表4 南瓜籽不同浓度提取物对DPPH自由基抑制率Table 4 Scavenging power of extracts from pumpkin seeds at different concentrations on DPPH free radicals

3.3.2 不同提取物还原能力

一般情况下，物质的还原能力越强，其抗氧化活性也越高[25-26]。提取物的还原能力见表5。由表5可知，吸光度值随着提取物浓度的增加而增大，表明南瓜籽的还原能力与其提取率成正比。

表5 南瓜籽不同浓度提取物的还原能力Table 5 Reduction capacity of extracts from pumpkin seeds at different concentrations

4 结论

通过单因素试验和Box-Benhnken Design中心组合试验设计原理，以提取率为考察指标，乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度四个因素为自变量，设计4因素3水平响应面法，得到南瓜籽最优提取条件为：70%乙醇，液料比20∶1 mL/g，提取时间120 min，提取温度80 ℃。为南瓜籽的提取提供参考依据。通过DPPH自由基清除能力和还原能力测定，表明南瓜籽提取物具有一定的抗氧化活性，且抗氧化能力与南瓜籽提取率成正比，为后续有关南瓜籽抗氧化提取物的深入研究提供参考。