叉叶茅膏菜组培快繁的研究

许 凤，张艺萍,,宋 杰，杨秀梅，王丽花，苏 艳，张丽芳，瞿素萍*

(1.云南省农业科学院 花卉研究所，云南 昆明 650205；2.国家观赏园艺工程研究中心，云南 昆明 650205；3.云南省花卉育种重点实验室，云南 昆明 650205)

茅膏菜(DroseraspatulataJ. E. Smith)为茅膏菜科(Droseraceae)茅膏菜属(Drosera)植物，又称石龙牙草、地上明珠等，在我国主要分布于长江以南和东北等地区，生于潮湿的山坡草地、灌丛、疏林及小溪流旁边等[1-2]。作为药用植物，茅膏菜具有解疮毒等功效[3]，同时其新奇的外形以及所独有的食虫植物的特殊形态结构,在花卉园艺界有着相当高的观赏价值，是一种极具经济价值的植物[4-7]。目前，有关茅膏菜属植物的研究主要集中于其药用价值[8-16]、食虫机制[17-18]、生态学研究[18-19]，对于其繁育技术的研究只限于少数种[20-24]。

随着市场需求量的不断增大，现有茅膏菜的数量已经供不应求，同时由于生态环境日益受损，湿地及林地资源不断缩减，茅膏菜家族已经濒临灭绝[25],对茅膏菜进行组织培养和离体快繁,可短期内培养出大量生长健壮、均匀一致的优质种苗,能够有效挽救匮乏的种质资源，填补市场供应的空缺。目前，并未见有关于叉叶茅膏菜组织培养的报道,因此本研究对于食虫植物的资源保护及应用推广具有重要意义[22]。

1 材料与方法

1.1 材料

供试叉叶茅膏菜为2018年引自浙江省嘉兴市，栽植于云南省农业科学院花卉研究所品种资源圃。于春夏季茅膏菜生长旺盛季节，花序伸直未显色时，剪下作为外植体。

1.2 外植体的消毒

参照杨爽等[22]的方法，并进行改进。具体方法为：将剪下的花序，用洗衣粉水清洗一遍后，在自来水下冲洗15～20 min。放入超净工作台，使用75%酒精处理30 s，再用0.15%氯化汞溶液处理5～8 min，之后用0.5%次氯酸钠混合液(100 mL 0.5%次氯酸钠溶液加入2滴吐温20配制而成)消毒10～20 min，具体设置见表1，最后用无菌水冲洗5次。

表1 外植体消毒试验

1.3 愈伤组织的诱导

外植体消毒完成后，用无菌滤纸将表面水分吸干，把花序底部的花序轴切除0.5 cm左右，然后把处理好的花序接种于不同的诱导培养基上进行愈伤组织诱导。愈伤组织诱导培养基以MS为基本培养基，设置不同浓度的6-BA、KT、NAA共组成6个组合(表2)。

表2 愈伤组织诱导培养基

1.4 叉叶茅膏菜的愈伤组织分化

选取生长情况一致的愈伤组织团，每团0.1 g，以MS为基本培养基，根据表3中的组合。每个组合分别接种3瓶，每瓶接种5团愈伤组织。在光照16 h/8 h(光/暗)，温度25 ℃/15 ℃(白天/昼夜)的条件下培养20 d后，对愈伤组织分化率、丛生芽苗高度、丛生芽状态进行观察并统计(表3)。

表3 愈伤组织分化培养基

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂组合对叉叶茅膏菜花序消毒效果的影响

不同的消毒剂组合及处理时间对叉叶茅膏菜花序的消毒效果见表4。从表4可以看出，相同时间的氯化汞处理后，随着次氯酸钠混合液处理时间的延长，外植体的污染率呈现下降趋势，而褐化率却呈上升的趋势，外植体成活率呈上升的趋势，这表明在氯化汞处理时间不变的前提下，延长次氯酸钠混合液的处理时间可有效降低污染率，但时间过长又会对供试材料产生伤害，导致褐化率升高，进而影响成活率。同时，在次氯酸钠混合液处理时间相同时，延长氯化汞的处理时间，污染率降低，但褐化率却升高。

表4 花序消毒试验结果

因此，本研究认为叉叶茅膏菜花序消毒的最适宜方法：75%酒精处理30 s后用0.15%氯化汞溶液消毒8 min，之后用0.5%次氯酸混合液处理15 min。

2.2 不同生长调节及诱导叉叶茅膏菜愈伤组织发生的影响

由表5可以看出，当NAA的浓度相同时，随着6-BA、KT浓度的提高，愈伤组织团的形成时间缩短，且愈伤组织的状态从致密向疏松变化。同时，从图1可以看出，当6-BA、KT的浓度达到2.0 mg/L时，愈伤组织出现玻璃化现象，因此，叉叶茅膏菜愈伤组织诱导培养基应选择B2、B5培养基。

图1 不同植物生长调节剂影响下产生的愈伤组织

表5 不同生长调节剂诱导叉叶茅膏菜愈伤组织发生的影响

2.3 不同植物生长调节剂对叉叶茅膏菜愈伤组织分化的影响

将B2和B5培养基诱导出的状态良好的愈伤组织转接到8种不同的分化培养基上。从表6和图2可以看出，相同浓度的不同植物生长调节剂对愈伤组织分化的影响是不同的，综合愈伤组织分化率、丛生芽高度、丛生芽状态来看，可以得出，对于愈伤组织分化影响的大小依次为：ZT>KT>6-BA>TDZ。相同的生长调节剂，不同浓度对愈伤组织分化的影响也是不同的，当ZT为0.5 mg/L时，芽较高，叶片过粗，生长过于成熟，不利于下一步进行丛生苗增殖培养；当ZT为0.1 mg/L，丛生苗高度适中，生长一致，丛生芽较多。因此，综合上述分析结果，本研究认为MS+ZT 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L是叉叶茅膏菜愈伤组织分化的最佳培养基。

图2 不同生长调节剂对叉叶茅膏菜愈伤组织分化的影响

表6 不同植物生长调节剂对叉叶茅膏菜愈伤组织分化的影响

2.4 叉叶茅膏菜的生根与移栽

叉叶茅膏菜丛生苗高度为2.5 cm左右时，将其接入到不加植物生长调节剂的MS培养基中培养10～15 d，再转入到MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.1 g/L+活性炭0.2 g/L+琼脂6 g/L+蔗糖15 g/L的生根培养基中。

将根长0.5 cm左右的幼苗连瓶转移到覆盖遮阳网的小拱棚中放置3～5 d，之后放入0.1%的百菌清液中浸泡10 min，冲洗干净，插入消毒过的且含饱和水的栽培基质(珍珠岩∶草炭=1.5∶1)中。

将种好苗的穴盘放入含接水盘的育苗箱中，之后放入覆盖遮阳率80%的小拱棚中，10 d后将育苗箱顶部的透气孔打开，之后每隔10 d向接水盘中注水进行浸盆，30 d后可获得移栽成活的苗。

3 讨论

建立叉叶茅膏菜组培快繁体系的首要目标是得到干净无菌的材料，本研究结果表明：叉叶茅膏菜花序外植体最佳的消毒方法组合：75%酒精30 s+0.15%氯化汞8 min+0.5%次氯酸混合液15 min。这与张国庆[20]的70%酒精30 s+0.1%氯化汞8 min、靖晶等[21]的75%酒精5 s+0.1%氯化汞5 min、杨爽等[22]的75%酒精30～60 s+0.1%氯化汞5～10 min有一定的差异。可能与本研究所用材料为花序，且为不同的品种有关。

本研究认为诱导叉叶茅膏菜产生愈伤组织的最适宜培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。在低浓度的6-BA和KT培养基中，叉叶茅膏菜虽然能产生愈伤组织，但时间较长，诱导率较低；在高浓度的6-BA和KT培养基中，诱导愈伤组织的效率较高，但是愈伤组织的状态为颗粒状且颜色为紫红色，不利于下一步愈伤组织的分化。

研究不同的生长调节剂及浓度对叉叶茅膏菜愈伤组织分化的影响，6-BA、KT、ZT、TDZ都能诱导愈伤组织分化，在相同浓度的生长调节剂作用下，以ZT的效果最好，分化出的芽较健壮；在高浓度的生长调节剂作用下，分化出的芽呈黄绿色或黄色，尤其当TDZ 1.0 mg/L时，分化出的芽还出现玻璃化现象，因此，适于叉叶茅膏菜愈伤组织分化的培养基为MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

4 结论

综上所述，对于叉叶茅膏菜最佳组培快繁体系的建立，最佳消毒处理方式：75%酒精30 s+0.15%氯化汞8 min+0.5%次氯酸混合液15 min；愈伤组织诱导的最适宜培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；愈伤组织分化的适宜培养基：MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L。