猪萨佩罗病毒原位杂交检测方法的建立

焦 哲，梁继翔，严治山，刘晓丽，谷长勤，胡薛英，程国富，张万坡

(华中农业大学 动物医学学院，湖北 武汉 430070)

猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus，PSV)是小RNA病毒科萨佩罗病毒属的一类无囊膜球形单股正链RNA病毒，主要通过粪—口传播，引起腹泻、肺炎、繁殖障碍等多系统综合征或无明显特征的亚临床症状[1]。PSV可与猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、肠道病毒等混合感染导致病猪临床症出现非典型症状[2-5]。由于PSV隐性感染以及混合感染往往使其造成的症状被掩盖而被忽略，造成PSV感染扩散，给我国养猪业带来巨大威胁[6]。目前PSV普遍存在国内规模化猪场中，华南、华东、西南等地猪场均有检出，因此检测PSV对其感染相关疾病的诊断十分重要[7]。原位杂交是目前最为有效的分子病理学、分子遗传学技术之一，但目前为止国内暂无PSV的原位杂交检测方法的报道[8]。本研究建立了一种猪萨佩罗病毒的原位杂交检测方法，为猪萨佩罗病毒在感染仔猪后器官和组织中病毒核酸分布及致病机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒株及抗体猪萨佩罗病毒及鼠抗PSV多克隆抗体由本实验室保存。

1.2 动物试验动物试验遵循《湖北省实验动物管理条例》中的规定，将经PSV RT-PCR检测阴性的21日龄的断奶仔猪分成2组，每组3头。感染组仔猪口服15 mL的 1×107TCID50/mL的PSV毒株，未感染组仔猪口服等量DMEM培养基作为对照。仔猪在接种后3 d后处死取其小肠组织甲醛固定后石蜡包埋。

1.3 主要试剂及仪器Easy Pure Viral DNA/RNA Kit试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品；M-MLV反转录试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，购自美国Roche公司；原位杂交仪购于美国StaSpinAbboaThermoBrite；Gel Extraction Kit购自Omega公司；Phanta Max Master Mi购于南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.4 引物的设计与合成根据GenBank上PSV的基因组序列，针对该病毒5′UTR基因序列利用DNAstar软件设计1对特异性引物。采用BLAST工具初步验证该引物的特异性。所设计的特异性上、下游引物序列分别为Sapelovirus-F:5′-ACACTCATTTCCCCCCTCCA-3′，Sapelovirus-R:5′- CGCCGAAGCGCGTCGCTAAC-3′，预期扩增的目的片段的长度为200 bp。上述引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 特异性探针的制备

1.5.1病毒RNA提取 取PSV病毒液200 μL，按全式金公司Easy Pure Viral DNA/RNA Kit试剂盒说明书进行抽提，病毒核酸抽提液立即用M-MLV反转录试剂进行cDNA的合成。

1.5.2PCR扩增目的条带 取1.5 μL cDNA用设计好的引物(F/R)进行PCR扩增，扩增程序如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 7 min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用OMEGA公司DNA凝胶回收试剂盒回收特异的目的扩增片段。

1.5.3DNA探针的标记 使用分光光度计测定PCR回收产物浓度后，取1 μg PCR回收产物按Roche公司地高辛标记试剂盒说明书进行DNA探针标记。

1.6 原位杂交常规制作石蜡切片，参照文献[9]对石蜡切片进行预处理后进行探针的杂交和显色，通过Nikon 80i生物光学显微镜和图像采集系统观察采集图像，并进行结果分析。

1.7 免疫组化为验证原位杂交结果准确性，对ISH检测的组织连续切片进行免疫组化，以鼠抗PSV一抗4℃孵育过夜，HRP标羊抗鼠/兔IgG复合物作为二抗，DAB显色后苏木素复染，中性树胶封片后光学显微镜观察并采集图像，并进行结果分析。

2 结果

2.1 动物试验结果感染组仔猪在接种后第2天均出现腹泻症状，采用孙杰等[10]建立的PSV RT-PCR方法对仔猪粪便进行PSV核酸的检测，检测的感染组3头仔猪粪便扩增结果均为阳性，对照仔猪结果为阴性。

2.2 特异性探针的制备结果PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外光检测结果显示，目的片段约为200 bp(图1)，与预期大小是相符的。

图1 PCR扩增目的条带结果 M.DL2000 Marker；1.PSV；2.阴性对照

2.3 PSV原位杂交结果地高辛标记的DNA探针与组织内PSV 的RNA特异性结合，经NBT-BCIP显色后呈蓝紫色，感染组仔猪小肠大量绒毛上皮细胞内见深蓝紫色颗粒，杂交结果呈阳性 (图2A)，肠绒毛固有层也有散在的阳性信号，阳性细胞主要是淋巴细胞和巨噬细胞(图2B)；未感染PSV对照组未出现阳性信号(图2C、D)。

图2 PSV组织原位杂交结果 A、B.感染组小肠组织原位杂交结果；C、D.阴性对照组小肠组织原位杂交结果

2.4 PSV免疫组化结果对ISH检测阳性的连续切片进行免疫组化染色。结果显示，阳性信号呈棕黄色，位于小肠绒毛上皮细胞的胞质中。观察染色结果可以发现这2种方法对PSV定位具有相同的结果(图3)。

图3 PSV组织免疫组化结果 A.感染组小肠组织原位杂交结果；B.连续切片免疫组织化学结果

3 讨论

近年来，随着养猪业规模化发展，猪病毒性腹泻的发病率呈现逐年递增的趋势，给养猪业带来严重的经济损失[11]。许多学者和专家认为猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒等是引起该类疾病的主要病原体[12]，而PSV等猪肠道病毒却一直没有引起重视，导致可供参考的猪肠道病毒研究资料甚少[13]。

本试验建立了组织中检测PSV的原位杂交检测方法，经免疫组化检测表明该方法具有很强的特异性，可用于PSV感染发病机制的研究和PSV实验室诊断。试验结果显示，阳性信号主要在感染组仔猪小肠大量绒毛上皮细胞内，这与KIM等[14]对PSV的免疫组化定位结果一致，研究表明，PSV以表面受体唾液酸神经节苷脂(α2,3-Linked Sialic Acid on GD1a Ganglioside)为受体进入宿主细胞，并且这类受体在猪肠道组织具有较高的表达，因此相较于其他组织，肠道黏膜上皮对PSV更易感[15]。本研究结果显示肠绒毛固有层中的淋巴细胞和巨噬细胞胞浆也有散在的阳性信号，这说明小RNA病毒复制中间体是局灶性或弥漫性存在于这些细胞的细胞质或细胞核中[16]。

我们利用PSV病毒为模板，通过RT-PCR扩增的方法直接用地高辛标记PCR产物合成PSV特异性探针，这种PSV特异性探针制备方法具有方便快捷的优点。对福尔马林固定的组织进行石蜡切片后与杂交的DNA探针相互作用，然后通过碱性磷酸酶标记的报告抗体用酶促反应显示，可使用光学显微镜直接观察，且ISH的优点是永久性染色，信号不会随着时间的推移而减少[17]。这种方法使用光学显微镜就可观察结果，可以同时观察组织形态且准确地反映病毒在组织中的状态与细胞的分布，具有较广泛的应用前景。