CRISPR/Cas9系统介导的人乳铁蛋白基因在山羊β-乳球蛋白基因座定点敲入

宋绍征 张 婷 潘生强 陆 睿 成 勇* 周鸣鸣*

(1.无锡太湖学院 护理学院， 江苏 无锡 214000；2.扬州大学 兽医学院/江苏省转基因动物制药工程研究中心，江苏 扬州 225009；3.江苏食品药品职业技术学院 制药工程学院，江苏 淮安 223003)

近年来牛乳过敏症体质者日渐增多[1]，因此研发改造不含致敏原的食用乳品至关重要。羊乳的成分更接近于人乳，可作为牛乳过敏体质者最理想的替代乳品[2]。研究表明山羊乳中β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，BLG)是引起人体过敏反应的主要致敏原，且酶水解、加热和糖基化处理也很难消除其致敏性，反而会加重过敏反应[3-4]。人乳铁蛋白(Human lactoferrin，hLF)是最初在人乳汁中发现的一种铁结合蛋白，具有抑菌和杀菌、抗病毒、调节免疫、促进铁元素吸收等多种生物学功能，是十分理想的乳品添加剂[5]。因此，消除或降低羊乳中致敏原，同时增加功能营养蛋白成分，是提高羊乳品质的一个重要研究方向。

CRISPR/Cas9系统是一种成簇规律间隔短回文重复序列，由sgRNA引导Cas9核酸内切酶特异识别靶基因位点，切割使DNA双链断裂，再经同源重组和非同源末端连接两种途径进行修复[6]，是一种新型基因打靶技术，具有简单、高效、精准且易获得纯合子突变体等特点，被广泛地应用于转基因动物细胞和个体的基因组定点精确编辑和修饰[7-9]。通过CRISPR/Cas9系统介导的基因打靶技术，可以对山羊致敏原BLG基因敲除和营养成分hLF基因敲入，通过内源调控机制在乳腺中特异表达hLF而不表达BLG，实现羊乳的“人源化”改造，从而改善乳品质量：田雨晨等[10]利用CRISPR/Cas9系统对牛胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因进行编辑；刘畅等[11]利用CRISPR/Cas9系统介导奶山羊胎儿成纤维细胞中的β-酪蛋白基因位点的打靶研究；周文君等[12]利用CRISPR/Cas9系统介导人乳铁蛋白在山羊耳成纤维细胞BLG基因座的打靶研究。这些研究虽然成功高效获得了基因打靶细胞，为羊乳蛋白基因编辑和“人源化”改造提供了研究价值，但仅局限于细胞水平的基因打靶研究，还未能获得存活的基因打靶山羊个体。因此，本研究拟利用CRISPR/Cas9系统基因编辑技术，在山羊中敲除致敏原BLG基因，同时定点敲入功能营养蛋白hLF基因，并通过体细胞核移植制备BLG-/hLF+基因打靶山羊胎儿，进而建立细胞系，以期为今后CRISPR/Cas9系统介导BLG基因座的定点精确修饰和精准基因分子遗传育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用萨能奶山羊和徐淮白山羊常规饲养于扬州大学实验农牧场。

BLC14质粒和菌种 (含山羊BLG3′调控序列和BLG5′调控序列、hLFcDNA、NEO基因、CMV增强子、PolyA信号)[13]，宿主菌DH5α(Escherichiacoli)， CRISPR/Cas9 二合一质粒构建试剂盒购自南京尧顺禹生物科技有限公司(AxyPrep PCR Clean-up Kit，Cat.No.AP-PCR-250)。

DMEM/F12培养液、FBS (Hyclone公司，美国)；G418、Trypsin (Amresco公司，美国)；M16、M2、青链霉素、透明质酸酶、细胞松弛素B、核荧光染料hochest 33342、6-甲基氨基蝶呤、离子霉素(Sigma公司，美国)；DNA 胶纯化回收试剂盒(QIAGEN 公司，德国)；DNA连接酶、限制性内切酶、DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司)；其他未说明试剂均为分析纯(上海生工生物工程有限公司和中国国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 引物设计及合成

本试验使用到的所有PCR引物均通过Primer Premier 5.0软件完成，由上海英骏生物技术有限公司完成引物的合成(表1)。

1.3 sgRNA设计及sgBLG/Cas9表达载体构建

针对山羊基因组中BLG基因座 (NCBI，Z33881.1，8 088 bp) 的第一外显子区域设计sgRNA，应用在线软件 (https:∥zlab.bio/guide-design-resources) 设计长度为22 bp 的sgRNA 引导序列，靶位点序列为GTGCCCCCACTTCTGGGGTCTA。然后通过常规分子生物学技术构建表达载体并命名为sgBLG/Cas9。

表1 研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 奶山羊胎儿成纤维细胞的分离及培养

按照参考文献[14]和[15]的常规细胞培养方法，通过无菌手术剖宫产取35日龄奶山羊胎儿，来进行原代细胞的分离与培养。

1.5 CRISPR/Cas9编辑山羊BLG位点致突变活性检测

待山羊胎儿成纤维细胞生长汇合度达到约80%时，收集细胞，用电转染液洗涤离心后，重悬细胞调整密度至1×106个/mL，进行转染。sgBLG/Cas9质粒经QIAGEN试剂盒纯化后与细胞悬液混合，然后调整质粒终浓度至15 μg/mL，进行电转染(条件：2.0 kV/cm、250 μs、电击2次，2 mm间隙电极杯，静置3 min)，使用DMEM/F12+10% FBS培养液重悬细胞，转移至六孔板内培养(条件：37 ℃、5% CO2、饱和湿度)，隔1 d换液1次。同时设置未转染的正常细胞作阴性对照。待细胞汇合至60%左右时，收集细胞，提取DNA，经PCR对靶标区域进行检测，扩增产物送上海华大基因科技有限公司进行测序。

1.6 CRISPR/Cas9系统介导的hLF基因打靶细胞系的建立

BLC14打靶载体经SalⅠ和NotⅠ双酶切线性化后，与sgBLG/Cas9表达载体混合，终浓度均调整至15 μg/mL，按照步骤1.5的方法和条件进行电转染，同时设置阴性对照(正常未转染的细胞)。2 d后，添加500 μg/mL G418 进行药物抗性筛选，定期换液(隔3 d)和观察。当阴性对照组的细胞全部死亡时(10～14 d)，在荧光倒置显微镜下挑取单克隆细胞集落，更换为正常培养液，置于48孔板内常规培养，传代于12孔细胞培养板内扩大培养。待汇合度至80%～90%时，重悬收集一部分细胞，提取基因组用作PCR检测。应用CMV-hLF-F/R引物进行人乳铁蛋白基因整合检测，应用5′BLG-hLF-F/R引物进行5′端靶位点同源重组检测，应用NEO-3′BLG-F/R引物进行另一侧的3′端靶位点同源重组检测。剩余细胞冻存以作供核细胞来制备转基因克隆山羊。

1.7 转基因克隆山羊的制备

按照参考文献[14-16]的方法，对性成熟的正常雌性徐淮白山羊进行超数排卵，获取供质的卵母细胞，且同步对受体羊进行发情处理。随后进行体细胞核移植、重构胚的融合与激活、胚胎受体移植、受体山羊妊娠诊断检测等，成功受孕后的山羊单圈常规饲养管理。

1.8 基因打靶克隆胎儿鉴定

妊娠山羊经无菌剖宫产手术获取35 日龄克隆胎儿，按照1.4的方法获得细胞系，通过PCR进行基因打靶鉴定，应用CMV-hLF-F/R引物进行人乳铁蛋白基因整合检测，应用5′BLG-hLF-F/R和NEO-3′BLG-F/R引物进行同源重组检测。

2 结果与分析

2.1 sgBLG/Cas9介导的山羊BLG基因座的打靶原理

根据山羊BLG基因第一外显子序列设计了长度为22 个碱基的sgRNA引导序列，并依据同源重组的原理，以BLC14乳腺特异性表达载体作为打靶载体，利用sgBLG/Cas9介导的山羊BLG基因敲除的同时定点导入hLF基因。由sgRNA 引导序列在山羊BLG基因座的打靶原理见图1。

图1 sgBLG靶位点和打靶原理示意图Fig.1 Schematic diagram of sgBLG target site and target principle

2.2 山羊胎儿成纤维细胞的形态结构

利用胰蛋白酶消化法(消化液：0.05%胰蛋白酶+0.04% EDTA)分离获得山羊胎儿成纤维细胞，经传3 代培养后的典型形态结构如图2所示。正常的原代(P0)山羊胎儿成纤维细胞形态瘦小，大部分呈现细长条状、长梭形或无规律性排列，属于一种常见的贴壁细胞(图2(a))。经传至第三代(P3)以后的胎儿成纤维细胞汇合至80%～90%时，细胞群通常呈现放射状、涡旋状或火焰状；当细胞密度大于90%时，肉眼可观察到有散落的白色集落形成于细胞群内，而且细胞间相互挤压呈现明显的细长条状(图2(b))。

图2 山羊胎儿成纤维细胞(标尺=10 μm)Fig.2 Goat fetal fibroblasts (Sale bar=10 μm)

2.3 CRISPR/Cas9编辑山羊胎儿成纤维细胞的BLG位点活性检测

将构建成功的sgBLG/Cas9表达载体转染山羊胎儿成纤维细胞后，提取细胞基因组DNA，使用sg-BLG-F/R引物进行PCR扩增，产物经测序后获得峰图，通过峰图的重叠情况来验证细胞系的突变程度(图3)。开始出现重叠的套峰处如图中箭头所指，即此处开始出现突变碱基(sgBLG/Cas9识别位点为山羊BLG基因第一外显子C)。根据这种重叠套峰所占峰面积的比例情况，可初步判断sgBLG/Cas9表达载体在山羊胎儿成纤维细胞中切割基因组DNA双链的致突变活性约为30%～35%。

图3 sgBLG/Cas9表达载体的 PCR活性检测峰截图Fig.3 Sequencing peak diagram of sgBLG/cas9 expression vector by PCR

2.4 hLF基因打靶细胞系的检测

BLC14基因打靶载体与sgBLG/Cas9表达载体共转染山羊胎儿成纤维细胞5×106个(细胞计数)，经G418筛选获得72株药物抗性细胞。应用CMV-hLF-F/R引物进行hLF基因整合检测，获得65株hLF转基因细胞，PCR扩增产物大小均为470 bp(图4(a))。应用5′BLG-hLF-F/R引物对hLF转基因细胞进行5′端同源重组检测，初步判断有37株为基因打靶细胞，PCR扩增产物大小均为4 708 bp(图4(b))。应用NEO-3′BLG-F/R引物对基因打靶细胞进行3′端同源重组检测，进一步验证该37 株细胞均为基因打靶细胞，PCR扩增产物大小均为2 402 bp(图4(c))。山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座定点打靶hLF基因的效率达51.4%(37/72)。

荧光倒置显微镜下观察细胞，挑取其中形态较好、饱满度高、折光性和立体感强的7株基因打靶细胞冻存以作核移植的供核细胞。

2.5 克隆胚的发育情况及基因打靶的验证

选择2.4中形态较好的7 株基因打靶细胞(Ts1～Ts7)，超排共获得709 枚山羊卵母细胞，去核卵548 枚，去核率为77.3%(548/709)；融合后获得452枚重构卵，融合率为82.5%(452/548)；激活后培养挑取较好的416 枚重构胚移植入30 只经同步发情处理的受体山羊输卵管中，30～35日，使用 B超对受体山羊进行妊娠诊断，13 只怀孕，妊娠率为43.3%(13/30)(表2)。

(a) hLF基因整合检测PCR图 hLF transgenic integration analysis of PCR；M: DL-2000 DNA marker; P: BLC14 载体; N: 未转染正常细胞; 1～22: 转染细胞.M: DL-2000 DNA marker; P: BLC14 vector; N: Untransfected normal cells; 1-22: Transfected cell samples.(b) 5′端基因同源重组检测PCR图5′ gene homologous recombination analysis of PCR；M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: 未转染正常细胞; 1～7: 转基因细胞.M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: Untransfected normal cells; 1-7: Transgenic cell samples.(c) 3′端基因同源重组检测PCR图3′ gene homologous recombination analysis of PCR；M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: 未转染正常细胞; 1～7: 转基因细胞.M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: Untransfected normal cells; 1-7: Transgenic cell samples.图4 PCR检测基因打靶细胞株图Fig.4 PCR analysis of gene targeting cell lines

手术剖宫产获取3 只35日龄胎儿 (图5分别为 Ts1-1、Ts5-1、Ts5-3克隆胎儿)。通过hLF基因整合检测和同源重组检测证明了该3 只胎儿均为BLG基因座打靶胎儿(图6)，并建立了BLG-/hLF+靶向性修饰细胞系。

表2 细胞核移植生产克隆胎儿统计Table 2 Statistics of the production of cloned fetuses by nuclear transfer

(a) Ts1-1克隆胎儿 Ts1-1 cloned fetus; (b) Ts5-1克隆胎儿 Ts5-1 cloned fetus; (c) Ts5-3克隆胎儿 Ts5-3 cloned fetus图5 35日龄BLG-/hLF+基因型克隆胎儿图片Fig.5 Images of three 35-day-old cloned fetuses of BLG-/hLF+ genotype

3 讨论与结论

CRISPR/Cas9系统是细菌和古生菌在长期演化过程中形成的一种能够抵御外来病毒或遗传物质入侵的获得性免疫防御系统，在植物、微生物、小鼠和大中型家畜细胞中已有较多的应用报道[9,16-17]，是近年来基因编辑领域的一大“利器”，也是应用最广泛的一种高效、精准、简单的基因编辑技术。利用CRISPR/Cas9系统介导的动物基因打靶技术可以对哺乳动物的乳蛋白基因组进行精准编辑修饰，在BLG等致敏原基因座定向置换hLF等功能营养蛋白基因，既可以降低或去除乳中致敏原又可以增加营养成分，改善消费者饮用乳品的质量，是动物乳产品“人源化”改造的新思路和新方法[16]。

(a) 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: 阴性对照; P: 阳性对照; M: DL-2000 DNA marker. 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: Negative control; P: Positive control; M: DL-2000 DNA marker.(b) 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: 阴性对照; P: 阳性对照; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker. 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: Negative control; P: Positive control; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker.(c) 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: 阴性对照; P: 阳性对照; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker. 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: Negative control; P: Positive control; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker.图6 BLG-/hLF+基因型打靶胎儿检测PCR图Fig.6 PCR detection of gene targeting fetuses of BLG-/hLF+ genotype

牛、羊等大中型家畜基因打靶的早期研究报道主要集中于长同源臂构建打靶载体、人工锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应蛋白核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)等，存在效率低、精准度低、筛选繁杂、难以获得完整的打靶动物个体等缺陷[18]。孙丽新等[19]在山羊β-酪蛋白基因位点定点敲入hLF基因的研究；Shen等[20]在山羊β-酪蛋白基因定点敲入htPAm基因的研究；张学明等[21]将gdnf基因定点导入牛β-casein基因座的打靶研究。但是，上述研究均没有获得存活的基因打靶动物个体，而且效率低下，脱靶现象极为严重。李雪玲等[11]利用TALENs基因编辑技术在奶山羊胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因的第二外显子的打靶研究，将打靶效率提高达到32.35%，为今后通过体细胞核移植技术制备敲除β-酪蛋白基因奶山羊提供了可选的供体细胞。本课题组通过TALENs技术在山羊BLG基因座定点敲入hLF基因的研究中，获得了6株BLG-/hLF+基因打靶细胞及1只打靶胎儿，为羊乳“人源化”及遗传育种提供了研究基础[15]。因此，一种高效的基因编辑技术亟待解决。Ni W和Polejaeva IA等[22]首次将CRISPR/Cas9系统成功地应用于山羊的基因编辑，从而开启了CRISPR/Cas9系统在山羊基因组中编辑的新篇章。

利用CRISPR/Cas9系统介导的乳蛋白基因编辑和羊乳“人源化”改造是目前乳腺生物反应器研究领域的热点。西北农林科学大学张涌团队等[10]率先利用CRISPR/Cas9系统对牛胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因进行编辑，打靶效率为9.7%；周文君等[12]利用CRISPR/Cas9系统介导人乳铁蛋白在山羊耳成纤维细胞BLG基因座的打靶研究，打靶效率为36.69%；刘畅等[11]利用CRISPR/Cas9系统针对山羊胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因的第二外显子进行打靶研究，打靶效率高达74.29%。但是，上述研究仍然局限于细胞水平，还没有在中靶动物个体水平进行研究，也没有存活的基因打靶动物个体出生。

本研究证实了CRISPR/Cas9系统能够介导山羊乳蛋白靶向基因敲入和敲出。共筛选出37株BLG-/hLF+基因打靶细胞，打靶效率为51.4%，远远高于传统的基因打靶效率[14,16]，与类似研究报道打靶效率相当[11-12]，而且妊娠率(43.3%)也远远高于其它相关研究报道[15]。最终通过无菌剖宫产获取克隆胎儿，建立BLG-/hLF+基因打靶细胞系，并进一步证明了均为BLG基因座定点打靶hLF基因胎儿和细胞系。此外，本实验室保存的BLC14基因打靶载体含有山羊BLG调控区、hLF功能基因、CMV增强子及药物抗性基因NEO，其在乳腺中特异性稳定表达能力在山羊、兔和小鼠中已经得到了良好的验证[13-16]。以上结果表明CRISPR/Cas9系统介导的BLG-/hLF+中靶细胞作为山羊体细胞核移植的供核细胞制备的重构胚具有类似干细胞的全能发育性和恢复发育成长至完整个体的潜能，而且在内源BLG基因座定向编辑置换hLF基因并未影响早期山羊胚胎的顺利发育。虽然有部分受体在中后期发育过程中出现妊娠终止情况，暗示基因打靶细胞可能会干扰克隆胎儿的发育程度，但已有研究也报道了随着重构胚胎的不断发育，中后期出现胎儿发育停滞的现象[20,23]。

本研究通过CRISPR/Cas9系统介导在山羊BLG基因座定向置换hLF基因，成功地获得了多株BLG-/hLF+基因打靶细胞，经核移植和剖宫产获得了该基因的中靶克隆山羊胎儿个体及靶向性修饰细胞系，为培育羊乳中低致敏原和富含hLF功能营养成分的转基因山羊新品系奠定了基础，也为羊乳“人源化”改造及其它乳蛋白基因编辑提供了科学依据。