青海云杉无性系的遗传多样性

赵祜，吕东，刘贤德，张宏斌，赵明，赵兴鹏，陈刚

(1.甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省祁连山水源涵养林研究院，甘肃 张掖 734000)

青海云杉(Piceacrassifolia) 为西北地区用材林、水源涵养林和城乡绿化观赏的优良树种，主要分布于我国青海、甘肃、宁夏、内蒙古等省(区)，其抗寒、抗旱、抗病虫.张掖市龙渠青海云杉种子园1984年部省联建，建园材料来源于西水、连城、东大山、大黄山等11个自然分布区，共收集260个青海云杉优良家系.40多年来，青海云杉种子园在区域的良种造林以及城市道路绿化中发挥了重要作用.目前，张掖市龙渠青海云杉无性系种子园中开展了半同胞子代测定以及优良家系选择[1]、无性系开花特性及种子园花粉流时空变化[2]、无性系雌雄球花及球果量变异研究[3]、无性系物候期对气象因子的响应研究[4]、半同胞子代苗期生长性状遗传分析[5]、无性系种子园开花习性、[6]、优良单株半同胞种子及其子代苗表型性状分析[7]等方面的研究.国内学者利用ISSR分子标记对10个青海云杉天然群体进行了遗传分析[8]，国外利用AFLP、SSR、EST-SSR等分子标记技术对云杉属树种进行了研究[9-20].目前，利用SSR分子标记技术尚未对张掖市龙渠青海云杉种子园无性系进行遗传多样性研究，无性系间亲缘关系还未有准确结论.本研究基于SSR分子标记技术，以青海云杉无性系种子园109个无性系为研究对象，分析青海云杉无性系遗传多样性和亲缘关系，以期为青海云杉高世代种子园的建立提供可靠的理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

从张掖市龙渠青海云杉种子园109个无性系单株上采集当年生嫩叶，清水清洗干净用硅胶干燥处理后带回实验室置于-80℃冰箱中保存.供试材料109个青海云杉无性系种源地如表1所示.

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 将处理好的青海云杉针叶剪成1 cm样本，运用改良CTAB法[21]提取青海云杉基因组DNA，用紫外分光光度计检测基因组DNA纯度，用核酸分析仪测定基因组DNA浓度，稀释为浓度为75 ng/μL，纯度D为1.8，母液放入冰箱中(-20 ℃)保存待用.

1.2.2 SSR-PCR反应体系的建立、优化及引物筛选 青海云杉SSR-PCR反应体系采用正交试验设计和单因素分析方法建立.采用5因素4水平正交试验方法，A因素Mg2+(25 mmol/L)4个水平A1～A4,分别为1.5、2.0、2.5、3.0 μL.B因素TaqDNA聚合酶B1～B4，分别为0.6、0.7、0.8、0.9 μL.C因素模板DNA (5～10 ng/μL)4个水平C1～C4，分别为0.5、 1.0、1.5、2.0 μL；D因素正反向引物4个水平D1～D4，分别为0.25、0.50、0.75、1.00 μL；E因素dNTP (10 mmol/L) 4个水平，E1～E4分别为0.35、0.40、0.45、0.50 μL.在其PCR反应体系中，首先加入10×PCR缓冲液13.4 μL，最后加入超纯水HPLC使PCR反应总体积达到20.0 μL.如表2和表3所示，设计试验中所用引物EAC1C08，序列(AC)36，对PCR的16种组合反应扩增产物进行电泳，根据电泳图谱，选择适合青海云杉的SSR-PCR反应体系.每个试验处理进行3次重复.最终得到青海云杉SSR-PCR最佳的反应体系.选用从挪威云杉中开发出的SSR引物60对进行测试[15]，筛选出多态性好，适用于青海云杉的有效引物.

1.3 数据处理

对上述操作得到的图谱进行分析，确定每个条带的基因型，依据分子量命名等位基因.采用POPgene version1.31软件[22]，计算出遗传多样性的复合参数[23-27]，多态性位点百分率(PPL)、多态性位点数(N)、观测等位基因数、有效等位基因数(ne)、期望杂合度(He)、Shannon′s多态性信息指数(I).无性系的遗传关系分析，根据SSR同源性条带是否存在，用矩阵表示结果，采用NTSYS-pc2.0软件[28]，基于Dice相似性系数构建UPGMA聚类图.

表1 109个青海云杉供试材料种源地统计

表2 青海云杉无性系SSR-PCR反应体系的正交设计因素水平

2 结果与分析

2.1 SSR-PCR反应体系的建立、优化及引物筛选

对影响PCR扩增结果的5个因素(Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、引物、退火温度)进行选择和优化，ISSR-PCR反应的最佳反应体系为19.75 μL，其中DNA (5～10 ng/μL)为1.0 μL，dNTP (10 mmol/L)为0.45 μL，正反向引物 (10 μmol/L)为0.25 μL，Mg2+(25 mmol/L)为2 μL，TaqDNA聚合酶 (5 U/μL)为0.8 μL，10×PCR缓冲液为2 μL、HPLC超纯水为13.25 μL.94 ℃预变性3 min； 94 ℃变性30 s，44个循环；50～60 ℃退火30 s(各引物退火温度不同)；72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸3 min.从已知合成的引物[29]中进行试验，从试验结果中筛选出10条扩增条带清晰、稳定性好的引物(图1).

表3 5因素4水平青海云杉SSR-PCR反应的正交试验设计

2.2 青海云杉无性系遗传多样性分析

基于已建立和优化的青海云杉无性系SSR-PCR反应体系，得出青海云杉无性系PCR产物各引物的编号、序列、最适退火温度Ta、有效等位基因数ne、观测杂合度Ho、期望杂合度He、Shannon信息指数I，如表4所示.

由表3可知，选取的10对引物的多态性比较高.试验共扩增出230个多态性条带，大小集中在100～800 bp之间.10对引物多态性位点百分率PPL为100.00%；10对引物ne大小顺序为：EAC7B09>EAC1A07>EAC1C08>EAC6F04> EAC6C02>EAC6D01> EAC7D10>SPL3AGG2>SPL3AGB4>EAC1F04)，ne为7.948 8～22.118 1；EAC7B09的ne达到了最高为22.1181；10对引物Ho的大小顺序为EAC1C08>EAC6D01>EAC7D10>SPL3AGG2>EAC6F04>EAC1A07=EAC1F04=EAC6C02=EAC7B09=SPL3AGB4=0.000 0，Ho变化范围比较小，为0～0.377 4；EAC1C08的Ho最高，达到了0.377 4；10对引物He大小为EAC7B09>EAC1C08>EAC6F04>EAC1A07>EAC6C02>EAC6D01>EAC7D10>SPL3AGG2>SPL3AGB4>EAC1F04，10对引物He的变化范围最小，为0.885 2～0.959 3，EAC7B09的He值最高，为0.959 3；Shannon′s 信息指数I大小顺序为EAC7B09>EAC1A07>EAC1C08>EAC6F04>EAC6C02>EAC6D01> EAC7D10>SPL3AGG2>SPL3AGB4>EAC1F04)，10对引物Shannon′s 信息指数为2.225 7～3.242 4，EAC7B09的I达到了最高，为3.242 4.

图1 10对青海云杉SSR引物电泳图谱(无性系编号1-30号)Figure 1 Electrophoretic patterns for 10 pairs of Picea crassifolia SSR primer selection(clones number 1-30)

表4 青海云杉10对SSR引物筛选及无性系遗传多样性参数

2.3 青海云杉无性系遗传关系

运用NTSYS软件进行相关分析，采用Dice相似系数加权类平均法(UPGMA)后聚类分析[29-30]，聚类分析结果如图2所示.109个青海云杉无性系得到了有效的区分，把109个无性系分成5个组，Ⅰ和Ⅱ组包含的无性系如图2所示；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组包含的无性系如图3所示.

3 讨论

物种和种群的进化程度对环境的适应能力取决于它们的遗传多样性.本研究采用SSR分子标记对张掖市龙渠青海云杉无性系种子园内的109个青海云杉无性系进行了遗传多样性研究，研究结果表明，青海云杉无性系具有较高的遗传多样性水平，研究结果与王文峰等[8]ISSRs标记对青海云杉10个天然群体遗传多样性研究的结果类似.造成青海云杉无性系具有较高的遗传多样性水平的原因可能有2个，原因一是因为本研究中的青海云杉无性系来源于祁连山区的西营河、西水、连城、哈溪、古城、东大山、大黄山、大河口、寺大隆、隆畅河、马蹄共11个自然分布区，地理来源广泛；原因二是青海云杉是异交风媒树种，个体间基因交流广泛，也会增加该树种的遗传多样性.本研究的青海云杉无性系遗传多样性指数(PPL=100.00%，He=0.921 0，I=2.774 7)，与其他的植物相比较(表5)，均高于生长于陕西的野生毛樱桃(He=0.672，I=1.280)[31]、生长于福建、贵州等地的杉木(He= 0.500，I=0.980)[32]、生长于陕西、甘肃等地的冷杉(He=0.841，I=2.130)[33]、生长于湖北的杜仲(He=0.379 8，I=0.643 3)[34].本研究结果将对张掖市龙渠青海云杉无性系种子园无性系合理配置、扩大种子园内种子的遗传基础、提高种子的遗传品质具有重要的现实意义.

4 结论

本研究采用SSR分子标记法对109个青海云杉无性系进行研究.通过建立并优化青海云杉的SSR-PCR反应体系筛选出的10对有效引物，基于SSR分子标记技术对其进行了遗传多样性研究，结果显示，109个青海云杉无性系遗传多样性分析中，共扩增出230条多态性条带，多态百分率(PPL)为100.00%，平均有效等位基因数(ne)为14.76，平均观测杂合度(Ho)为0.06，平均期望杂合度(He)为0.92，平均Shannon′s多态性信息指数(I)为2.77，揭示了青海云杉无性系间的遗传多样性较为丰富；对109个青海云杉无性系采用UPGMA 聚类分析方法后将109个青海云杉无性系分为5组，聚类分析结果与种子园建园材料的地理来源广泛及个体间基因交流广泛相吻合.

图2 109个青海云杉无性系聚类图Figure 2 The cluster diagram of 109 clones of Picea crassifolia

图3 109个青海云杉无性系聚类图Figure 3 The cluster diagram of 109 clones of Picea crassifolia

表5 青海云杉与其他物种遗传多样性比较