合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性及稳定性研究

刘 鹏,刘瑜倩,兰太进,黄攒诗,罗荣将,陆安扬,张远鸿,林 江

(广西中医药大学基础医学院,广西南宁 530200)

马氏珠母贝(Pinctadamartensii),又名合浦珠母贝(Pinctadafucata),隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamelli branchia)、珍珠贝目(Pterioida)、珍珠贝科(Pteriidae)、珠母贝属(Pinctada),为我国南方生产海水珍珠的主要贝类,主要分布于我国广西、广东、海南[1-2]。合浦珍珠盛产于广西北海合浦,是我国国家地理标志产品[3-4]。珍珠粉自古药食同源,千百年来一直被奉为纯天然养颜美容、功能性食品,是具有价值的营养成分和生物活性物质的来源[5-6]。研究表明,合浦珍珠的化学成分包括无机物质、有机物质和水。无机物质主要是碳酸钙[7-9];有机物质主要是小分子活性多肽、多糖、核酸、8种人体必需氨基酸以及十多种与人体新陈代谢相关的氨基酸,且包含一些具有特殊生理活性的非蛋白氨基酸,如牛磺酸等;另外还含有铜、铁、镁、锰、钠、锌、锶等微量元素,种类齐全,且比例组合形式符合人体需要[10-11]。

合浦珍珠作为传统名贵的道地药材,历代中医典籍对合浦珍珠的性味功效皆有明确记载,如明朝李时珍所著的《本草纲目》写道:“珍珠味咸,甘寒无毒。镇心点目。涂面,令人润泽好颜色。涂手足,去皮肤逆胪,坠痰,除面斑,止泄。除小儿惊热,安魂魄。止遗精白浊,解痘疗毒”[12];现代典籍《中华人民共和国药典》及《中药大辞典》亦记有:“珍珠具有安神定惊、明目去翳、解毒生肌、润泽肌肤”的功效[13]。合浦珍珠粉因功效显著且无毒副作用等特点,常出现在各类方剂、保健食品中[14]。如Knijnenburg等[15]报道,纳米珍珠粉在健康成人中显示出良好的钙吸收和保留性能,可以提高骨骼和血清钙水平,增加股骨重量和长度;另珍珠粉被台湾妇女广泛用作孕期和产后的健康补充剂[16-17];珍珠粉含有丰富的氨基酸、有机钙、硒、锌等微量元素,能在短时间内补充机体钙质,并提供一些微量金属元素,从而改善免疫系统,可用作高级保健食品的原料[18];珍珠粉具有良好的抗氧化性能,Yang等[19]证实珍珠粉能抑制2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐诱导的人红细胞氧化溶血、脂质过氧化和红细胞膜蛋白的氧化损伤;珍珠粉含有丰富的蛋白质,Chiu等[20]以秀丽隐杆线虫为模型,通过体外和体内实验,证实珍珠粉蛋白提取物是一种有效的抗氧化剂,能延长线虫寿命,表明珍珠粉可以作为功能性食品开发,用于一些年龄相关性退行性疾病的保健养生。很多天然物质具有良好的抗菌性能,常被开发为食品或添加剂[21],而合浦珍珠粉作为一种无毒的天然海洋活性物质,关于其抗菌性能的研究目前国内外尚鲜少报道。

本研究以合浦珍珠粉为原材料,采用超声-酸解-加热联合处理法制备合浦珍珠提取物,以金黄色葡萄球菌为试验菌,采用牛津杯法、二倍梯度稀释法等评价合浦珍珠提取物的体外抑菌效果,并探讨其抑菌活性的稳定性,旨在为综合利用合浦珍珠这一珍稀药食兼用海洋生物资源提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

合浦珍珠粉 北海市宝珠林海洋科技有限公司;金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923、胰蛋白胨、酵母膏、氯化钠、琼脂粉等常规试剂 北京索莱宝科技有限公司。

UV-1800型紫外可见分光光度计 上海美谱达;Synergy H1型全功能酶标仪 美国BioTek;THZ-300C型恒温摇床(可制冷) 上海一恒科学仪器有限公司;XY-SH-150-Ⅲ型智能生化培养箱、XY-JH-11C型个人型单面超净台 上海昕仪仪器仪表有限公司;SCIENTZ-12N型普通型冷冻干燥机 宁波新芝冻干设备股份有限公司;YXQ-LS-100A型内循环立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;RH basic 2型经济型加热磁力搅拌器 德国IKA(艾卡)公司;牛津杯(内径(6±0.1) mm,外径(7.8±0.1) mm,高(10±0.1) mm) 江苏三爱思科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 合浦珍珠提取物的制备 参考Yang等[22]方法并进行一定修改。准确称取5.0 g合浦珍珠粉末,按1∶40 g/mL比例加入5%醋酸溶液,室温下超声破碎,破碎条件:功率250 W,工作时间5 s,间歇时间5 s,全程30 min;随后室温下继续磁力搅拌6 h,调节pH为7.0,再转移至40 ℃的恒温箱中磁力搅拌过夜,结束后于沸水中保持15 min,冷却后4 ℃ 5000 r/min离心15 min,取上清,用1 mol·L-1NaOH溶液调节pH至7.0,冻干成粉,室温保存。

1.2.2 合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性试验 采用牛津杯法检测合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性。从LB固体平板上挑取金黄色葡萄球菌单菌落,接种到5 mL新鲜的LB液体培养基中,37 ℃ 180 r/min振荡培养4 h至生长对数期,稀释到1×106CFU·mL-1。移液器移取200 μL菌悬液,均匀涂布于LB固体平板上,用无菌镊子将灭菌干燥后的牛津杯置于平板表面,轻轻按压固定,吸取200 μL浓度为200 mg·mL-1的合浦珍珠提取物(pH=7.0)加到牛津杯中,阴性对照组为200 μL无菌水,每组设置三个平行实验,4 ℃扩散3 h后,正置于37 ℃培养箱中,培养24 h观察抑菌圈的形成,并使用游标卡尺测量抑菌圈大小[23]。

1.2.3 最小抑菌浓度MIC的测定 采用二倍梯度稀释法测量合浦珍珠提取物的最小抑菌浓度[24]。方法同上制备金黄色葡萄球菌1×106CFU·mL-1菌悬液。使用无菌96孔板进行最小抑菌浓度检测,在每孔中加入100 μL稀释后的菌悬液,随后加入100 μL不同浓度的无菌水稀释的合浦珍珠提取物,各组浓度如下:240.00、120.00、60.00、30.00、15.00、7.50、3.75、1.88、0.94、0.47和0.24 mg·mL-1,阴性对照组为无菌水,以不添加菌液和合浦珍珠提取物的LB培养液作为空白对照,每组平行3个孔,置于37 ℃培养箱中培养24 h,随后使用酶标仪检测OD600,测定合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的MIC。

1.2.4 合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌生长的影响 同1.2.2方法,制备金黄色葡萄球菌浓度为1×106CFU·mL-1的菌悬液。对照组为无菌水,实验组为0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC、64×MIC和128×MIC,迅速混匀置于37 ℃静置培养。合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的生长影响实验时间点选择0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51 h 18个时间点,以不添加菌液和合浦珍珠提取物的LB培养液作为空白对照,每组设置三次平行实验,采用96孔法检测合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌生长的影响。

1.2.5 温度对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响 采用7.5 mg·mL-1浓度的合浦珍珠提取物进行实验,将其分别在-80、-20、4、25、37、60、80和100 ℃下处理30 min,以金黄色葡萄球菌为指示菌,设置三次平行实验,采用96孔法分别检测不同温度对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响。

1.2.6 反复冻融对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响 采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物进行实验,将其置于-20 ℃冷冻,随后室温下快速解冻,冻融次数分别为0、1、2、3、4、5和6次,以添加等体积的无菌水作为对照,设置三次平行实验,采用96孔法分别检测反复冻融对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响。

1.2.7 pH对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响 将120 mg·mL-1合浦珍珠提取物分别与pH为3.0、5.0、7.0、9.0和11.0的无菌水以1∶1的比例混合,置于4 ℃ 24 h,再将所有组别pH调至7.0,且用无菌水分别将其体积调为一致确保合浦珍珠提取物的浓度一致,最终采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物进行实验,采用96孔法分析不同pH对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响。

1.2.8 紫外线照射对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响 采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物进行实验,将其敞开放置在20 W紫外灯光下,分别照射0、5、10、15、20、25和30 min,以金黄色葡萄球菌为指示菌,设置三次平行实验,采用96孔法检测紫外线对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响。

1.2.9 金属离子对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响 采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物进行实验,使用15 mg·mL-1的合浦珍珠提取物分别与不同浓度0、25、50、100和200 mmol·L-1的NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2溶液等体积混合,设置三次平行实验,置于37 ℃处理1 h,随后采用96孔法分析不同离子强度对合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌抑菌活性的影响。

1.2.10 胰蛋白酶与胃蛋白酶对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响 将胰蛋白酶加入pH为7.0的30 mg·mL-1的合浦珍珠提取物中,胃蛋白酶加入pH为2.0的30 mg·mL-1的合浦珍珠提取物中,酶的终浓度均为1.0 mg·mL-1,37 ℃处理1 h,再用100 ℃处理5 min,终止酶反应,室温12 000 r/min离心5 min,收集上清,调节pH为7.0,过滤除菌,使用7.5 mg·mL-1浓度的合浦珍珠提取物进行实验,未经酶处理的合浦珍珠提取物作为对照,设置三次平行实验,采用96孔法分析蛋白酶对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响。

1.3 数据处理

所有实验数据采用Graphpad prism 6.0分析合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用,SPSS 19.0软件进行单因素方差分析,P<0.05,表明具有显著性差异,P<0.01,表明具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 合浦珍珠提取物的制备及对金黄色葡萄球菌的抑菌活性

本实验采用超声破碎联用酸解法制备合浦珍珠提取物,冻干成粉(如图1A),使用无菌去离子水溶解为240.00 mg·mL-1,用于后续实验。采用牛津杯法检测合浦珍珠提取物抑菌活性,根据是否有抑菌活性判断标准进行判断:抑菌圈直径大于6 mm判断为有抑菌活性,小于等于6 mm为无抑菌活性;3次重复实验均达到有抑菌活性结果者判为合格。阴性对照组应无抑菌圈,否则实验视为无效[25]。其中抑菌圈直径大于6 mm小于10 mm视为低度敏感;大于10 mm小于15 mm视为中度敏感;大于15 mm视为高度敏感[26]。结果显示,提取物对金黄色葡萄球菌具有强抑菌活性,抑菌圈直径为(17.861±0.948) mm(如图1B),高度敏感。

图1 合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌抑菌活性实验Fig.1 Antibacterial activity of Hepu pearl extracts against S. aureus注:A:合浦珍珠提取物冻干粉;B:合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈实验,1:阴性对照;2～4:合浦珍珠提取物240.00 mg·mL-1。

2.2 合浦珍珠提取物最小抑菌浓度的测定

采用96孔法检测合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度,结果显示,37 ℃培养24 h后,空白组无细菌生长,其他各组均有细菌生长。通过组间单因素方差分析,与阴性对照组比较,0.94～240.00 mg·mL-1的合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌生长抑制具有极显著性差异(F=34.909,P<0.01),最低抑菌浓度为0.94 mg·mL-1,且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果呈一定的剂量依赖关系(如表1)。

表1 合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度实验Table 1 Experiment on the MIC of Hepu pearl extract on S. aureus

2.3 合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌生长影响

如图2所示,在LB培养基中加入浓度为0.5×MIC的合浦珍珠提取物,金黄色葡萄球菌的生长基本不受影响,随着提取物浓度的增大,对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用越明显,且当添加的合浦珍珠提取物浓度≥2×MIC时,金黄色葡萄球菌的生长受到显著(P<0.05)抑制,与阴性对照相比,其延缓期明显延长。

图2 合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌生长影响Fig.2 Effects of Hepu pearl extract on the growth of S. aureus

2.4 温度对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响

如图3 所示,以金黄色葡萄球菌的OD600值为指标探讨提取物抑菌活性[27],-80～80 ℃处理30 min,与4 ℃处理组相比抑菌活性相对稳定,但与100 ℃处理30 min抑菌活性相比有所下降,大约为4 ℃的68%,但与对照组相比,所有处理组仍具有极显著(P<0.01)的抑菌活性。表明合浦珍珠提取物表现出良好的热稳定性。

图3 不同温度对合浦珍珠提取物抗菌活性的影响Fig.3 Effect of different temperature on the antibacterial activity of Hepu pearl extracts注:“**”表示与对照相比,P<0.01,差异极显著;图4～8相同。

2.5 反复冻融对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响

如图4所示,-20 ℃反复冻融提取物1～6次,其抑菌活性与未冻融组相比无显著变化,且与对照组相比,仍有显著的抑菌活性。表明合浦珍珠提取物中抑菌活性物质在反复冻融的情况下仍具有稳定的抑菌活性。

图4 反复冻融对合浦珍珠提取物抗菌活性的影响Fig.4 Effect of repeated freezing-thawing on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.6 pH对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响

如图5所示,合浦珍珠提取物在pH3.0～9.0范围内的抑菌活性保持稳定,但在pH11.0时略有下降,相比pH7.0提取物抑菌活性保留约70%,但总体上与对照相比菌仍有极显著(P<0.01)抑菌活性。表明合浦珍珠提取物中的活性物质具有良好的酸碱稳定性,在强酸强碱条件下仍具有抑菌活性。

图5 pH对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响Fig.5 Effect of pH on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.7 紫外线对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响

如图6所示,合浦珍珠提取物经20 W紫外线处理5～30 min后,与未经紫外线处理组相比,抑菌活性无显著变化。说明合浦珍珠提取物中的活性物质能够对抗紫外线的破坏,保证其在自然环境中也能发挥较好的抑菌活性。

图6 紫外线对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响Fig.6 Effect of ultraviolet ray on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.8 金属离子对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响

如图7所示,合浦珍珠提取物在25～200 mmol·L-1的NaCl、KCl、CaCl2条件下,抑菌活性基本不受影响,但在25～200 mmol·L-1MgCl2条件下,抑菌活性逐渐降低,在200 mmol·L-1MgCl2条件下时,抑菌活性相比未添加金属离子组保留约40%;但与对照相比仍有显著抑菌活性,分析可能是高浓度的Mg2+与提取物中的活性物质结合,对其结构有一定的影响,从而使其抗菌活性略有降低[28]。

图7 金属离子对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响Fig.7 Effects of metal ions on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.9 胰蛋白酶和胃蛋白酶对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响

如图8所示,与未经处理的提取物组相比,胰蛋白酶处理1 h后的合浦珍珠提取物抑菌活性有所下降,相对抑菌活性保留约70%,但相比对照组仍有极显著(P<0.01)抑菌活性;而经胃蛋白酶处理后的提取物,抑菌活性丧失。表明合浦珍珠提取物对胰蛋白酶具有一定的耐受性,但对胃蛋白酶较为敏感。

图8 胰蛋白酶和胃蛋白酶对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响Fig.8 Effect of trypsin and pepsin on antibacterial activity of Hepu pearl extract

3 结论

本研究采用超声-酸-加热联合法制备合浦珍珠提取物,以金黄色葡萄球菌标准菌株为试验菌,探讨合浦珍珠提取物的体外抑菌活性及抑菌稳定性。牛津杯实验表明合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌活性,最小抑菌浓度为0.94 mg·mL-1,且呈一定的剂量依赖效应;并且≥2×MIC的合浦珍珠提取物能显著(P<0.05)抑制金黄色葡萄球菌的生长;合浦珍珠提取物表现出良好的抑菌稳定性,对温度不敏感,耐酸碱,对紫外线和反复冻融和金属离子其抑菌活性比较稳定,对胰蛋白酶稳定,但对胃蛋白酶比较敏感,总体上合浦珍珠提取物表现出了良好体外抑菌活性和稳定性。在后续研究中,课题组拟将结合体内实验探讨其抑菌作用和安全性评价,分析其对其他细菌、真菌的抑菌活性,后续将对提取物进行分离鉴定,获得具体活性单体物质,从而为推广合浦珍珠资源综合利用和精深加工奠定一定基础。