饲用α-半乳糖苷酶活性检测方法的探讨

李灵平

（河南省畜产品质量监测检验中心，河南 郑州 450008）

α-半乳糖苷酶又称蜜二糖酶，是一种外切糖苷酶类，可以催化不同含有α-半乳糖苷类物质的底物，α-半乳糖苷是由1 个蔗糖与1 个或多个半乳糖以α-1，6-糖苷键连接而成的不溶于水的低聚糖，广泛存在于畜禽饲料中，大豆、豆粕、棉粕、菜籽粕等α-半乳糖苷含量较丰富。由于单胃动物（畜禽）体内缺乏水解α-半乳糖苷糖类的酶，食糜中α-半乳糖苷不能被消化吸收利用，在动物肠道内大量聚集，使动物产生腹泻等症状，是饲料中主要的抗营养因子之一，这种抗营养因子会降低饲料中糖类和蛋白质的利用率。α-半乳糖苷酶在饲料中添加应用已相当普及，可以作为饲料添加剂提高饲料利用率，是降解饲料中抗营养因子α-半乳糖苷的关键酶。α-半乳糖苷酶作为一种新型饲料添加剂，在饲料工业应用日益广泛。酶制剂活性的测定是酶制剂应用效果评价的重要组成部分，也是评价酶制剂最直接、经济有效的方式，然而作为衡量酶制剂质量的重要指标——酶活力的检测，国内至今还没有统一标准，还没有国家标准或行业标准测定方法，使得α-半乳糖苷酶酶活性的检测比较混乱。

α-半乳糖苷酶广泛存在于植物、微生物和哺乳动物某些组织中，来源不同，其测定方法和原理有差异，微生物发酵生产是其重要来源途径，α-半乳糖苷酶的微生物生产菌株主要有利用基因工程菌株如大肠杆菌、毕赤酵母菌诱导表达，还有通过自然筛选选育出的乳酸菌、芽孢杆菌、青霉、木霉、曲霉菌等。据研究报道所知，α-半乳糖苷酶活性的测定，可以按照作用底物能力划分，α-半乳糖苷酶作用水解半乳糖苷的寡糖底物通常为棉子糖、水苏糖、蜜二糖和毛蕊花糖等，工业上常用的有三种检测方法测定α-半乳糖苷酶的活性，一是葡萄糖氧化酶法，通常以蜜二糖为底物，用葡萄糖氧化酶酶解蜜二糖为葡萄糖，再用warburg 压力计测定其含量法；二是Nelson/Somogyi 比色法，通常以棉子糖为底物，棉子糖经酶解后用Nelson/Somogyi 还原糖分析法测定还原糖含量而计算出α-半乳糖苷酶酶活力；三是以对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρ NPG）为底物ρNPG法，以ρNPG为底物，经酶解后测定对硝基酚的含量计算出α-半乳糖苷酶酶活力。三种测定方法用于饲用α-半乳糖苷酶酶活力的测定比较分析，葡萄糖氧化酶法测定步骤较繁琐复杂；Nelson/Somogyi 还原糖分析法由于饲料中成分复杂，含有豆粕、棉粕等半乳糖苷类成分等影响测定的干扰因素多，另外，饲用酶制剂的载体含量较多，还原糖含量较高，导致测定结果不准确；对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）为底物的ρNPG法，饲料中与ρNPG结构类似物少，具有抗干扰能力强，操作方便等特点，较适宜用于饲用α-半乳糖苷酶酶活力的测定，α-半乳糖苷酶的优选底物是对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρ NPG），优选方法为对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）为底物ρNPG法。其测定方法如下。

1 酶活力定义

α-半乳糖苷酶活性单位：在一定条件下，每分钟分解ρNPG 底物生成1 μmol 对硝基酚所需的酶量为一个α-半乳糖苷酶酶活单位。

2 原理

α-半乳糖苷酶与对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖（ρNPG）反应后，生成有色物质对硝基（苯）酚，通过吸光度值的变化得出对硝基（苯）酚的生成量，即可计算出α-半乳糖苷酶酶活力。

3 仪器与设备

pH计：精确到0.01 pH值；分析天平：感应0.0001 g；紫外-可见分光光度计：波长准确度±1 nm，吸光度值精确至0.001；恒温水浴槽：控温精度±0.5 ℃；离心机；磁力搅拌器：附加热功能；秒表；移液器：精度1μL。

4 主要试剂

无水醋酸钠（AR）；冰醋酸（AR）；碳酸钠（AR）；对硝基酚（ρ-nitrophenol，ρ NP）标准品（纯度99%）；对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρ-nitrophenyl-alpha-D-galactopyr anoside，ρNPG）（纯度98%）（AR）；试验用水符合GB/T6682规定的二级水标准。

5 试剂配制

5.1 pH值5.0醋酸钠缓冲液

A：0.05 mol/L 醋酸钠缓冲液：称取无水醋酸钠4.2 g 定容至1 000 mL。

B：冰醋酸溶液：称取冰醋酸3.0 mL定容至1 000 mL。用B调节A至pH值5.0即成。

5.2 0.2 mol/L碳酸钠溶液

0.2 mol/L 碳酸钠溶液：称取21.198 g 无水碳酸钠，定容至1 000 mL。

5.3 10 mmol/L对硝基（苯）酚标准（储备）溶液

10 mmol/L对硝基（苯）酚标准溶液：准确称取0.1391g对硝基（苯）酚，用0.2 mol/L 碳酸钠溶液定容至100 mL，4℃下保存。

5.4 10 mmol/L对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）溶液

10 mmol/L 对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）溶液：称取0.3031g 对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG），用0.05 mol/L pH值5.0醋酸钠缓冲液定容至100 mL，置棕色试剂瓶于4℃下保存。

6 分析步骤

6.1 标准曲线的绘制

依次移取10 mmol/L 对硝基（苯）酚标准（储备）溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，用0.2 mol/L 碳酸钠溶液定容到100 mL，配成浓度即为0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L 的对硝基苯酚标准工作液。

分别吸取0.5 mL 对硝基酚标准工作溶液（做3 个重复）于试管中，分别加入0.5 mL 醋酸钠缓冲液；然后在对照的空白样试管中加入1.0 mL 醋酸钠缓冲液（做3 个重复）；在所有试管中加入4.0 mL 碳酸钠溶液，振荡，在405 nm处测定吸光度OD值。

对硝基酚标准曲线绘制：以对硝基酚浓度（x）为横坐标，吸光度值OD405值（y）为纵坐标，绘制标准曲线。用Excel做出标准曲线，要求R2＞0.999。

6.2 酶液的制备

6.2.1 固体样品待测酶液制备

酶液制备：通过“四分法”精确品称取α-半乳糖苷酶1.0 g 左右，用醋酸钠缓冲液溶解然后定容至100 mL，37 ℃水浴，150 r/min震荡30 min，3 000 r/min离心20 min，过滤得上清液即粗酶液备用。

根据酶活力高低，可将粗酶液适当稀释，使吸光度值OD405值在0.1～0.6之间，所得酶活力较为准确。

样品测定：将粗酶液和ρNPG底物溶液于37 ℃下水浴预热10 min，然后再吸取各溶液0.5 mL 充分混合，37 ℃恒温水浴10 min，加入4.0 mL 碳酸钠溶液，振荡混匀，终止酶反应，在405 nm 测定吸光值。

空白测定：另取0.5 mL 稀释酶液和4.0 mL 碳酸钠溶液37 ℃预热3 min，然后加入ρNPG 底物溶液，37℃水浴10 min，在405 nm 测定吸光值，作为空白对照。

6.2.2 液体样品待测酶液制备

将液体样品待测酶液3 000 r/min离心20 min，过滤得上清液即为粗酶液备用。

根据酶活力高低，可将粗酶液适当稀释，使吸光度值OD405值在0.1～0.6之间，所得酶活力较为准确。

样品测定：称取α-半乳糖苷酶酶液和ρNPG底物溶液于37 ℃下水浴预热10 min，然后再吸取各溶液0.5 mL 充分混合，37 ℃恒温水浴10 min，加入4.0 mL 碳酸钠溶液，振荡混匀，终止酶反应，在405 nm 测定吸光值。

空白测定：另取0.5 mL 酶液和4.0 mL 碳酸钠溶液37 ℃预热3 min，然后加入ρNPG 底物溶液，37℃水浴10 min，在405 nm 测定吸光值，作为空白对照。

7 酶活计算

7.1 固体样品

按照标准曲线回归方程计算α-半乳糖苷酶酶活力，其计算公式如下：

α-半乳糖苷酶酶活力（U·g-1）A＝[（Ax-A0）×K+C0]×Df/mt

式中：Ax：样品酶液吸光度OD值；A0：空白吸光度OD值；K：对硝基（苯）酚标准曲线的斜率；C0：对硝基酚标准曲线的截距；Df：稀释倍数；m：称取样品质量/g；t：反应时间/min。

7.2 液体样品

按照标准曲线回归方程计算α-半乳糖苷酶酶活力，其计算公式如下：

α-半乳糖苷酶酶活力（U·mL-1）A＝[（Ax-A0）×K+C0]×Df/vt

式中：Ax：样品酶液吸光度OD值；A0：空白吸光度OD值；K：对硝基（苯）酚标准曲线的斜率；C0：对硝基酚标准曲线的截距；Df：稀释倍数；v：吸取样品酶液体积/mL；t：反应时间/min。

8 讨论

α-半乳糖苷酶作为一种活性微生物制剂，它对温度、反应pH 值十分敏感，不同菌株生产的纤维素酶最适作用pH 值、最佳作用温度有所不同，测定方法有待进一步探讨。

考虑到饲用酶制剂的作用环境，饲用酶制剂的作用位点是动物的消化道，其反应的pH值和温度与工业酶制剂最高酶活条件差异，建议反应温度37 ℃，反应体系pH 值5.0条件下进行。