TRIM28在胃癌中表达的临床意义及对胃癌细胞侵袭和迁移的影响

宁婷婷 徐俊玄 刘 思 闵 力 朱圣韬

(首都医科大学附属北京友谊医院消化分中心 国家消化系统疾病临床医学研究中心 消化疾病癌前病变北京市重点实验室 北京消化中心，北京100050)

胃癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，根据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)最新统计数据[1]，2018年胃癌发病率和病死率分别位居全球恶性肿瘤的第五位和第三位。根据国家癌症中心最新统计数据[2]，2015 年我国新发胃癌病例约40 万，死亡病例约29 万，分别位居我国恶性肿瘤的第二位和第三位。胃癌的发病原因复杂，在分子水平上进行机制研究，尤其是探索新的分子标志物与治疗靶点，对于促进胃癌诊疗，提高患者的预后具有重要意义。

三结构域蛋白(tripartite motif-containing protein，TRIM)家族成员广泛、功能复杂，已被证实与细胞增生、DNA 损伤修复、细胞内信号转导以及免疫反应等多种生理过程相关[3]。此外，TRIM家族蛋白参与多种疾病的发生、发展过程，包括癌症、炎性疾病、传染性疾病、神经精神疾病、染色体异常和发育性疾病等[4]。作为TRIM家族蛋白的一员，TRIM28可能参与了多种肿瘤的发生发展。据报道[5-8]，乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌以及非小细胞肺癌等恶性肿瘤中，TRIM28作为致癌因子，可通过多条信号通路促进肿瘤的侵袭和迁移。然而TRIM28在胃癌中的表达、侵袭迁移等生物学功能及其潜在分子机制尚不清楚。本研究拟分析TRIM28在胃癌组织和细胞中的表达情况以及TRIM28表达与胃癌患者预后的关系，并进一步通过细胞实验探讨TRIM28表达调控对胃癌细胞侵袭、迁移能力的影响及潜在的分子作用机制，以期为胃癌患者提供新的诊断生物标志物和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

TRIM28、β-catenin、c-Myc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单抗购自美国Abcam 公司；二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)购自美国Sigma公司；DMEM/F12培养基和磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)购自美国Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和胰蛋白酶(Trypsin)购自美国Gibco公司；Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司。超纯水仪购自美国Millipore公司；恒温CO2细胞培养箱购自日本三洋公司；无菌细胞培养瓶和细胞培养板购自美国Corning公司；多功能酶标仪购自美国MD公司；TRIM28 siRNA购自中国吉玛基因公司。

1.2 生物信息分析

从TCGA官方网站上下载胃癌患者的mRNA表达数据，分析比较胃癌患者与健康正常人中TRIM28的mRNA表达水平。同时利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析TRIM28表达水平与胃癌患者预后的相关性。

1.3 细胞培养与转染

AGS人胃癌细胞株购自美国标准培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，培养于含10%(体积分数)FBS的DMEM/F12培养基中，置于37℃含5%(体积分数)CO2的细胞培养箱中。培养AGS细胞密度至50%～70%，应用Lipofectamine 3000试剂分别转染control siRNA(健康对照组，NC组)以及TRIM28 siRNA(siTRIM28组)，依据转染试剂说明书进行操作。TRIM28 siRNA 购自苏州吉玛有限公司。si-TRIM28-1序列为5′-GGAGAUGAUCCCUACUCAA-3′，si-TRIM28-2序列为5′-GCGUGCAAGUGGACGUUAATT-3′，NC siRNA序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。

1.4 实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)

细胞总RNA提取按Trizol说明书进行，TRIM28的RT-PCR检测引物为5′-AAGGACCATACTGTGCGCTCTAC-3′(正向)与5′-ACGTTGCAATAGACAGTACGTTCAC-3′(反向)。GAPDH的qPCR检测引物为5′-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′(正向)与5′-AGACAACCTGGTCCTCAGTGT-3′(反向)。

1.5 Transwell试验

将不含血清的NC组和siTRIM28组的细胞悬液均匀接种在24孔板中，采用特制的Matrigel Invasion Chamber，在下室加入750 μL含10%(体积分数) FBS的培养基，上室加入500 μL细胞悬液(无血清)，继续在孵箱培养24 h，用镊子小心取出Chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800 μL甲醇的孔中，室温固定30 min后DAPI 染色，观察计数。

1.6 划痕愈合试验

将NC组和siTRIM28组的细胞以5×105的细胞浓度均匀接种在6孔板中，培养至细胞汇合。使用无菌移液管尖端在每个孔中进行划痕处理。用无菌PBS进行洗涤以清除细胞碎片，然后在不含FBS的纯培养基中培养。在6 h的时间点，在每孔的相同位置拍摄记录迁移状态。

1.7 Western blotting

取NC组和siTRIM28组的细胞，用细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)提取总蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度后煮沸变性10 min。每孔加样蛋白约30 μg 左右，按参考文献[9]进行操作，凝胶成像分析仪采集图像并分析TRIM28、β-catenin和c-Myc蛋白。

1.8 统计学方法

图1 TRIM28在胃癌中的表达及与胃癌患者预后的关系Fig.1 TRIM28 was highly expressed in gastric cancer and correlated with the outcome of patientsA: Analysis of TRIM28 in TCGA gastric RNA-seq data from 33 normal and 374 tumor samples (****P<0.000 1); B: Analysis of TRIM28 expression in GES-1 cell line and three gastric cancer cell lines (reference cell: GES-1, n=3); C-F: The relation of TRIM28 expression and overall survival of all (C), intestinal (D), diffuse (E), and mixed (F) gastric cancer; TRIM28: tripartite motif-containing protein 28.

2 结果

2.1 TRIM28在胃癌中的表达及与胃癌患者预后的关系

2.1.1 TRIM28在胃癌组织中的表达

基于TCGA胃癌转录组的数据，分析胃癌组织和正常胃组织中TRIM28的表达。结果(图1A)显示，胃癌组织中TRIM28 mRNA的相对表达量明显高于正常胃组织，差异具有统计学意义(P<0.000 1)。

2.1.2 qRT-PCR检测TRIM28在胃癌细胞中的表达

利用qRT-PCR检测本科室自存的胃癌细胞系(AGS、HGC-27和BGC-823)和永生化胃黏膜上皮细胞GES-1中TRIM28的表达情况。结果(图1B)显示，与永生化胃黏膜上皮细胞GES-1相比，TRIM28在3株胃癌细胞系中的表达上调。其中AGS细胞系中TRIM28表达水平最高。

图2 敲低TRIM28对胃癌细胞的侵袭迁移能力的影响Fig.2 Silencing TRIM28 resulted in reduced invasion and migration properties of gastric cell line AGSA: The efficiency of TRIM28 knockdown in AGS cells (***P<0.001, n=3); B: Images of Transwell invasion test showed decreased invasion capability of AGS cells with knockdown of TRIM28; C: Quantification of the Transwell invasion assay results (**P<0.01, n=3); D: Images of wound healing migration test showed decreased migration capability of AGS cells with knockdown of TRIM28; E: Quantification of the wound healing migration assay results (*P<0.05, n=3); NC: normal control; TRIM28: tripartite motif-containing protein 28.

2.1.3 TRIM28与胃癌患者生存期的关系

为了进一步明确TRIM28表达与胃癌预后之间的关系，笔者利用Kaplan-Meier Plotter数据库的胃癌数据集进行在线生存分析。Meier Plotter数据结果显示：TRIM28表达水平对患者的总生存时间有显著影响。与低表达组相比，TRIM28高表达组胃癌患者的总存活时间缩短(P=4E-16)(图1C)；同样TRIM28的表达水平对肠型胃癌患者(P=1.7E-11)(图1D)和弥漫型胃癌患者(P=0.004 8)(图1E)具有相同的影响；但是对于混合型胃癌(图1F)，TRIM28表达水平与胃癌患者的预后无统计学相关性(P=0.37)。

2.2 敲低TRIM28对胃癌细胞的侵袭迁移能力的影响

2.2.1 siRNA敲低TRIM28基因的效率

为验证si-TRIM28的基因敲低效率，以NC组及si-TRIM28-1 /si-TRIM28-2转染48 h后的AGS细胞提取总mRNA进行qRT-PCR实验。结果(图2A)显示，在转染处理后，与对照组相比，si-TRIM28处理组TRIM28的mRNA水平显著下降，证明si-TRIM28效果可靠，为后续功能学实验提供了保障。

2.2.2 TRIM28对胃癌细胞的侵袭能力的影响

利用Transwell试验检测TRIM28对AGS胃癌细胞侵袭能力的影响。结果(图2B、C)显示，TRIM28基因敲低后，侵袭细胞的数量显著减少，与NC组相比，差异具有统计学意义(P< 0.01,n=3)。

2.2.3 TRIM28对胃癌细胞的迁移能力的影响

利用划痕愈合试验检测TRIM28对AGS胃癌细胞迁移能力的影响。结果(图2D、E)显示，TRIM28基因敲低后，AGS细胞的迁移能力明显下降，与NC组相比，差异具有统计学意义(P<0.05,n=3)。

2.3 TRIM28对Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达水平的影响

利用Western blotting试验检测TRIM28对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平的影响。结果如图3所示，TRIM28基因敲低后，β-catenin以及下游靶基因c-Myc的蛋白表达水平明显下降。这些结果表明，TRIM28能够激活Wnt/β-catenin信号通路。

图3 干扰TRIM28后c-Myc和β-catenin的表达下调Fig.3 Western blotting showed downregulation of c-Myc and β-catenin in AGS cells with knockdown of TRIM28NC: normal control; TRIM28: tripartite motif-containing protein 28.

3 讨论

TRIM家族在结构上高度保守，从N端到C端的顺序依次为锌-指结构(RING box)、1个或2个B-box结构域和1个卷曲螺旋结构域。TRIM家族涉及多种生物学过程，如细胞凋亡、细胞分化、发育、肿瘤发生等[3]。近年来，TRIM家族与肿瘤发生发展的关系也逐渐受到关注[3]。研究[10-12]表明，多种TRIM家族成员在胃癌的发生、发展中扮演着重要角色。作为TRIM家族中重要的一员，TRIM28在肿瘤中的作用日益受到重视[5-6, 13-15]。然而，TRIM28在胃癌发生、发展中的作用机制目前尚未有报道。

在本研究中，笔者通过生物信息学分析和体外实验来研究TRIM28在胃癌中的表达和功能及其分子机制。结果显示，胃癌组织和细胞株中TRIM28表达水平均明显上调，而且TRIM28的异常高表达与胃癌患者预后差有关；这说明TRIM28与胃癌紧密相关，并有作为诊断胃癌的生物标志物的潜力。此外，本研究体外功能学实验结果表明，干扰TRIM28可以抑制胃癌细胞侵袭和迁移。总体而言，本研究结果证明TRIM28可以促进胃癌细胞的侵袭和迁移。

TRIM家族蛋白作为致癌因子，可以通过Wnt信号通路在细胞增生、侵袭和迁移等恶性生物学行为过程中发挥关键作用，而且主要是通过Wnt/β-catenin信号通路。TRIM59通过调节Wnt/β-catenin 信号通路，进而促进神经母细胞瘤的增生[16]；甲状腺癌中，干扰TRIM44可以下调β-catenin及其下游靶基因cyclin-D1和c-Myc的表达，进而抑制甲状腺癌细胞的增生、侵袭、迁移以及上皮间叶转化[17]；在肝细胞癌中，TRIM66通过促进β-catenin降解复合物中的GSK-3β磷酸化，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进肝细胞癌的发生发展[18]；在卵巢癌中，干扰TRIM28可以下调Wnt/β-catenin信号通路的β-catenin、支架蛋白(Axin)、T细胞因子1(T-cell factor 1, TCF1)和淋系增强子结合因子1(lymphoid enhancer binding factor 1, LEF1)，进而抑制卵巢癌细胞侵袭、迁移和上皮间叶转化等[13]。笔者猜测，在胃癌中TRIM28也可能参与对Wnt/β-catenin信号通路的调控。本研究进一步采用Western boltting法检测β-catenin和下游靶基因c-myc的表达情况，结果显示，在胃癌中TRIM28能够活化Wnt/β-catenin 信号通路。

综上所述，本研究显示，胃癌组织和细胞株中TRIM28高表达，而且TRIM28高表达的胃癌患者预后相对较差。TRIM28在胃癌进展过程中作为癌基因发挥作用，并可能通过Wnt/β-catenin 信号通路促进胃癌细胞的侵袭和迁移。今后进一步深入研究TRIM28将有望为治疗胃癌提供新的有效的治疗靶点。值得注意的是，异常表达的TRIM28能否成为诊断胃癌的生物标志物，需要检测更多样本，同时还应检测患者和正常人群血液中TRIM28的表达情况。