海南桑叶资源营养指标及危害因子分析

张 震,许永进,张善英,符笃韩,章程辉,王 萌

(1.海南大学食品科学与工程学院,海南海口 570228; 2.海南创科农旅集团,海南海口 571100; 3.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(海口),海南海口 570228; 4.海南大学植物保护学院,海南海口 570228)

海南桑品种资源丰富,现行主栽桑品种繁多。海南桑蚕产业规划是以琼中县为中心,向全省中西部地区辐射扩展。截至目前,海南省已有6个市县在发展桑蚕产业,累计种植桑园面积3.2万亩。其中，琼中县种植桑园面积2.5万亩,昌江县种植6000亩,屯昌县种植800多亩,临高县和定安县各种植180多亩,万宁市种植20多亩[1-3]。随着桑产业可持续发展理念的建立,通过对资源的高效多元化利用,实现桑产业效益最大化目标的建立,桑叶的多元化利用也受到了越来越多的关注,例如桑叶在食品、医药的领域的多元化应用已初见成效[4]。桑叶作为家蚕的唯一饲料来源,用于养蚕是对桑树最传统、最直接的利用方式。桑叶曾被传统中国古代药学如《本草纲目》、《神农本草经》记载为抗菌、消炎的良药。随着现在医药学的快速发展,在诸多研究中发现桑叶具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖、降血脂、调节脂肪代谢等保健功效[5-13],因而我国国家卫生部将其列为“药食同源”的植物资源。当今,桑叶已被开发为诸多食品,如桑叶饼干、桑叶豆腐、桑叶茶、桑叶菜等[14-19]。

桑叶中含有多种营养物质及活性成分,如粗蛋白、纤维素、生物碱、可溶性糖、多酚、总黄酮、1-脱氧野尻霉素(DNJ)等[20-22],所以近年来桑叶的食用、药用品质综合评价的诸多研究主要集中在多个营养指标以及一个或多个活性成分指标的分析评价与比较。梁贵秋等[23]对广西地区的21个品种桑叶中的维生素、蛋白质、微量元素、氨基酸和膳食纤维等营养品质指标,以及多酚、总黄酮、多糖、1-脱氧野尻霉素等活性成分的含量进行评价筛选;曾卫湘等[24]对53种桑种质桑叶中的多糖、DNJ、总黄酮含量进行测定,并进行评价分析;孙小静[25]对干制桑叶菜的蛋白质、单宁、多酚、叶绿素、可溶性糖、纤维素等11项品质指标含量进行综合评价。上述营养物质及活性成分的评价研究更集中于桑叶的食用、药用品质。农药对于防止农作物的病虫害及提高作物产量方面具有关键作用,但是在农业生产上为了大幅的提高生产效益而过度使用农药,使得农药残留问题愈发严重。此外由于环境污染,土壤中重金属残留量也日益受到关注。因此,在关注桑叶的营养和功能成分的同时,需要更加关注其中的重金属含量及农药残留量,从而将有益成分与危害因子结合进行综合评价桑叶品质。

通过对海南蚕区主栽桑品种的桑叶部分营养成分含量及危害因子进行检测分析,能够评价供试品种桑叶的品质,并从中筛选适宜桑叶食用、药用开发的专用桑树品种。本研究对海南省主栽产区的25个不同种质桑叶中的粗蛋白、纤维素、Cu元素、Zn元素、Pb元素、Cd元素、As元素含量、农药残留量进行测定,并采用因子分析法对其指标进行分析,最后得出综合得分,筛选出适宜用于开发食用、药用的本地桑品种,此研究结果将为海南桑产业转型升级和食药用桑等多元化利用发展提供理论基础和品种支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑叶 来源如表1所示;丙酮 分析纯,国药集团化学试剂公司;乙酸乙酯、无水乙醇、乙腈、氯化钠、硼酸、盐酸、甲基红、溴钾酚绿、凯氏定氮法催化剂片、蒽酮(分析纯),硫酸(纯度≥98%) 广州化学试剂厂。

表1 25个桑叶品种资源信息Table 1 25 species of mulberry leaf resources

AL204-IC电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;WBK-1A恒温水浴锅 春兰仪器厂;HM-723 723型分光光度计 上海驰唐实业有限公司;XW-80A涡旋混合器 上海青浦沪西仪器厂;XY2000C精密电子天平 北京金志业仪器设备有限责任公司;K9840自动凯氏定氮仪 海南丹丽设备销售公司;R210旋转蒸发仪 瑞士步琦;H-1650离心机 湖南湘仪;WATERS2695液相色谱仪 德国Waters;SPH-2008摇床 上海世平设备有限公司;TURBOVAC氮吹仪 美国Caliper;7890N气相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司;6890N气相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司;SB-5200DTS超声波清洗器 宁波新芝生物科技;消煮管、漏斗、茄形瓶、具塞比色管 广州市典锐化玻实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 将采摘的鲜桑叶样品置于55 ℃恒温干燥箱烘干至恒重,粉碎,过100目筛,避光保存。

1.2.2 营养指标的检测方法 粗蛋白含量:参照GB 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定[26];纤维素含量:采用蒽酮比色法进行测定[25,27];重金属含量:Cu、Zn、Pb、Cd、As五种重金属元素含量分别参照GB 5009.13-2017《食品中铜的测定》、GB 5009.14-2017《食品中锌的测定》、GB 5009.12-2017《食品中铅的测定》、GB 5009.15-2014《食品中镉的测定》、GB 5009.11-2014《食品中总砷及无机砷的测定》食品国家安全标准进行测定。

1.2.3 25个不同桑树种质桑叶品质指标因子分析及相关性分析 采用因子分析法对桑叶的多项品质指标进行客观、科学的综合评价。采用SPSS 24. 0软件对数据进行因子分析,在进行综合得分的计算之前,先将不同指标数据统一标准化,统一转化为0～1的标准化数据,将粗蛋白、纤维素、Cu元素、Zn元素等正相关指标按照式(1)进行转化;将Pb元素、Cd元素、As元素等负相关指标按照式(2)进行转化,最后各样品的综合得分通过式(3)进行计算。

式(1)

式(2)

式(3)

式中,Dn为经因子分析法得到的各样品品质的综合得分;Fjn为第n个样品第j个特征根>1 的公因子的分值;Ej为第j个公因子的方差贡献率;m为特征根>1的公因子的个数。

1.2.4 农药残留检测方法

1.2.4.1 样品处理 桑叶样品的有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类农药的检测条件参照NY/T 761-2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》中的有机氯、有机磷、氨基甲酸酯农药类检测条件进行[28-29]。将采回来的桑叶共25个样本干样按照标签分别打碎装瓶备用。分别称取30.0 g桑叶样本,按照1∶3的比例,加入90 mL乙腈用均质机研磨,然后用布氏漏斗抽滤,将收集到的滤液装到装有5～7 g NaCl的具塞量筒中,上塞,剧烈振荡1 min,在室温下静置30 min,使乙腈相和水相分层。分别取15 mL上层滤液到标有GC-Cl的旋蒸瓶中,然后旋蒸至近干用洗耳球吹干残余液体。

1.2.4.2 有机磷农药检测仪器参数 使用Agilent 6890N气相色谱系统的预柱选用1.0 m,0.53 mm内径的脱活石英毛细管柱,分析柱采用两根色谱柱,A柱选用50%聚苯基甲基硅氧烷柱(DB-17,30 m×0.53 mm×1.0 μm);B柱选用100%聚甲基硅氧烷柱(DB-1,30 m×0.53 mm×1.50 μm)为固定相;进样口温度220 ℃,起始温度150 ℃,保持2.0 min,然后以8 ℃/min升至250 ℃保持12.0 min;以氮气作为载气,纯度≥99.999%,流速设为10 mL/min,燃气为氢气,纯度≥99.999%,流速设为75 mL/min,助燃气为空气,流速为100 mL/min;进样量为1.0 μL,不分流进样。

1.2.4.3 有机氯农药检测仪器参数 有机氯农药检测仪器参数为:使用Agilent 6890N气相色谱系统的预柱选用1.0 m,0.25 mm内径的脱活石英毛细管柱,分析柱采用两根色谱柱,A柱选用100%聚甲基硅氧烷柱(DB-1,30 m×0.25 mm×0.25 μm);B柱选用50%聚苯基甲基硅氧烷柱(DB-17,30 m×0.25 mm×0.25 μm)为固定相;进样口温度200 ℃,起始温度150 ℃,保持2.0 min,然后以6 ℃/min升至270 ℃保持8.0 min;以氮气作为载气,纯度≥99.999%,流速设为1 mL/min,辅助气为氮气,纯度≥99.999%,流速设为60 mL/min;进样量为1.0 μL,设置分流比为10∶1。

1.2.4.4 氨基甲酸酯类农药检测仪器参数 氨基甲酸酯类农药检测仪器参数为:使用Waters 2695液相色谱系统配有柱后衍生反应装置和荧光检测器(FLD),预柱选用4.6 mm×4.5 cm内径的C18柱,分析柱选用4.6 mm×25 cm,5 μm,柱温42 ℃;荧光检测器(λex330 nm,λex465 nm),水解温度100 ℃,衍生温度室温;进样量为20.0 μL,不分流进样。

1.2.4.5 有机氯农药检测前处理 a.净化:向标有GC-Cl的旋蒸瓶加入2.0 mL甲醇+二氯甲烷(1+99),倒入用4.0 mL甲醇+二氯甲烷(1+99)预淋洗过的氨基柱,用2.0 mL甲醇+二氯甲烷(1+99)冲洗旋蒸瓶后淋洗氨基柱,并重复一次。然后将滤液旋蒸,用甲醇溶解过0.22 μm滤膜定容至自动进样器样品瓶,备用;b.有机氯标准溶液配制:用分析天平准确称取一定量(精确到0.0001 g)某农药标准品,以丙酮作溶剂,逐一配成1000 mg/L的单一农药标准储备液,贮存在-18 ℃以下冰箱中。每个单标取100 μL,用丙酮定容至4 mL,配成2.5 ppm的混标,然后取200 μL上述混标,加丙酮定容至1 mL,即稀释到0.5 μg/mL,装在进样瓶中备用。

1.2.4.6 有机磷农药检测前处理 a.净化:标有GC-P的旋蒸瓶直接用丙酮溶解过0.22 μm滤膜定容至自动进样器样品瓶,备用;

b.有机磷标准溶液配制:用分析天平准确称取一定量(精确到0.0001 g)某农药标准品,用丙酮作溶剂,逐一配成1000 mg/L 的单一农药标准储备液,贮存在-18 ℃以下冰箱中。每个单标取100 μL,用丙酮定容至4 mL,配成2.5 ppm的混标,然后取200 μL上述混标,加丙酮定容至1 mL,即稀释到0.5 μg/mL,装在进样瓶中备用。

1.2.4.7 氨基甲酸酯检测前处理 a.净化:标有GC-MS、LC的旋蒸瓶加入2.0 mL甲醇+二氯甲烷(1+99),倒入用4.0 mL甲醇+二氯甲烷(1+99)预淋洗过的氨基柱,用2.0 mL甲醇+二氯甲烷(1+99)冲洗旋蒸瓶后淋洗氨基柱,并重复一次。然后将滤液旋蒸,用甲醇溶解过0.22 μm,滤膜定容至自动进样器样品瓶,备用;

b.氨甲基酸酯标准溶液配制:用精度为0.0001 g的分析天平准确称取一定量(精确到0.0001 g)某农药标准品,用丙酮作溶剂,逐一配成1000 mg/L的单一农药标准储备液,贮存在-18 ℃以下冰箱中。每个单标取100 μL,用甲醇定容至1 mL,配成10 μg/mL的混标,然后取50 μL上述混标,加甲醇定容至1 mL,即稀释到0.5 μg/mL,装在进样瓶中备用。

1.3 数据处理

所有试验数据的处理分析均采用Microsoft Excel 2007软件,对试验数据进行因子分析和相关性分析采用SPSS 24.0软件。

2 结果与分析

2.1 25个桑品种桑叶中的营养成分含量比较

海南省三个地区25个桑叶品种的粗蛋白、纤维素、重金属元素Cu、Zn、Pb、Cd、As含量如表2所示。

表2 桑叶样品粗蛋白、纤维素、重金属元素含量Table 2 Contents of crude protein,cellulose and heavy metals in mulberry leaves

2.1.1 桑叶粗蛋白含量比较 由表2可知,在供试的三个地区25个品种桑叶样品的粗蛋白、纤维素、重金属元素含量均存在着不同程度的差异。儋州地区桑叶样品粗蛋白含量分布在20.13%～25.79%,平均值23.39%。琼中地区桑叶样品粗蛋白含量分布在25.41%～28.45%,平均值26.81%。万宁地区桑叶样品粗蛋白含量分布在25.09%～29.71%,平均值27.04%。琼中地区和万宁地区桑叶样品粗蛋白含量高于儋州地区,而琼中和万宁地区桑叶样品粗蛋白含量无明显差异。25个品种桑叶粗蛋白含量分布在20.13%～29.71%,平均值24.37%,变异系数9.43%。粗蛋白含量最高的桑叶品种为008。郑莎等[30]测定了45份不同品种桑叶粗蛋白含量,含量为13.61%～24.97%,平均值为20.08%;本研究中桑叶粗蛋白平均含量高于其测量结果,可能是由于其桑树生长环境存在差异,海南四季平均气温相对较高、昼夜温差小且雨水充足,所以更加适宜桑树生长。

2.1.2 桑叶纤维素含量比较 儋州地区桑叶样品纤维素含量分布在37.08%～46.20%,平均值42.18%;琼中地区桑叶样品纤维素含量分布在38.22%～52.57%,平均值43.54%;万宁地区桑叶样品纤维素含量分布在41.33%～42.62%,平均值41.94%。琼中地区桑叶纤维素平均含量最高。25个品种桑叶纤维素含量分布在37.08%～52.57%,平均值42.37%,变异系数7.55%。纤维素含量最高的桑叶品种为007。梁贵秋等[23]测定桑叶中的纤维素含量质量分数分布43.69%～54.90%,平均为48.63%。与其相比本研究中桑叶纤维素含量略低,可能由于其品种之间存在差异。

2.1.3 桑叶重金属元素含量比较 儋州地区桑叶样品Cu含量分布在6.45～9.84 mg/kg,平均值7.89 mg/kg。琼中地区桑叶样品Cu含量分布在8.49～9.36 mg/kg,平均值8.78 mg/kg。万宁地区桑叶样品Cu含量分布在8.27～9.90 mg/kg,平均值9.13 mg/kg。25个品种桑叶Cu含量分布在6.45～9.90 mg/kg,平均值8.18 mg/kg,变异系数12.31%,Cu含量最高的桑叶品种为010,不同地区不同品种桑叶之间的差异较小。

儋州地区桑叶样品Zn含量分布在23.30～41.30 mg/kg,平均值31.93 mg/kg。琼中地区桑叶样品Zn含量分布在28.20～35.60 mg/kg,平均值32.58 mg/kg。万宁地区桑叶样品Zn含量分布在34.80～38.00 mg/kg,平均值36.00 mg/kg。25个品种桑叶Zn含量分布在23.30～41.30 mg/kg,平均值35.52 mg/kg,变异系数13.29%,Zn含量最高的桑叶品种为001,不同地区不同品种桑叶之间的差异较小。易新萍等[31]测定了新疆地区不同品种桑叶中的Cu元素含量分布在9.04～19.30 mg/kg,平均值12.82 mg/kg。易新萍等测定了新疆地区不同品种桑叶中的Zn元素含量分布在21.00～42.70 mg/kg,平均值31.63 mg/kg。海南地区桑叶Cu含量低于新疆地区桑叶中Cu含量,而海南地区桑叶Zn含量略高于新疆地区桑叶Zn含量,上述结果可能是由于两个地区土壤中的金属元素含量存在差异,从而导致桑叶中Cu元素、Zn元素含量存在差异。

儋州地区桑叶样品Pb含量分布在0～0.400 mg/kg,平均值0.105 mg/kg。琼中地区桑叶样品Pb含量分布在0.029～0.091 mg/kg,平均值0.049 mg/kg。万宁地区桑叶样品Pb含量分布在0～0.50 mg/kg,平均值0.167 mg/kg。万宁地区桑叶样品Pb含量高于其他两个地区,25个品种桑叶Pb含量分布在0～0.500 mg/kg,平均值0.103 mg/kg,变异系数118.68%,不同地区不同品种之间差异很大。

儋州地区桑叶样品Cd含量分布在0.0020～0.0220 mg/kg,平均值0.0056 mg/kg。琼中地区桑叶样品Cd含量分布在0.0014～0.0088 mg/kg,平均值0.0046 mg/kg。万宁地区桑叶样品Cd含量分布在0.0018～0.0056 mg/kg,平均值0.0036 mg/kg。儋州地区桑叶样品Cd含量高于其他两个地区,25个品种桑叶Cd含量分布在0.0014～0.0220 mg/kg,平均值0.0052 mg/kg,变异系数85.47%,不同地区不同品种之间差异很大。

儋州地区桑叶样品As含量分布在0.028～0.230 mg/kg,平均值0.11 mg/kg。琼中地区桑叶样品As含量分布在0.030～0.070 mg/kg,平均值0.048 mg/kg。万宁地区桑叶样品As含量分布在0.090～0.110 mg/kg,平均值0.097 mg/kg。25个品种桑叶As含量分布在0.028～0.230 mg/kg,平均值0.099 mg/kg,变异系数53.50%,不同地区不同品种之间差异很大。朱卫敏[32]测定了新疆地区不同品种桑叶的十种金属元素含量,其中Pb、Cd、As元素含量的平均值分别为2.08、0.0210、1.335 mg/kg,新疆地区桑叶中三种元素含量均高于海南桑叶中三种元素含量,其原因可能是由于两个地区土壤中的金属残留以及化肥的使用量不同所导致。上述25个品种桑叶的重金属元素检测量均未超出限量值,安全风险较低。

2.2 25个不同桑树种质桑叶品质指标相关性分析

对不同桑树种质桑叶品质指标进行相关性分析,目的是揭示各指标间密切关联程度,从而为桑树种质桑叶品质指标的合理选择提供依据,如表3所示,粗蛋白与Cu元素呈显著正相关(P<0.05);粗蛋白与Zn元素呈极显著正相关(P<0.01);Cu元素与Zn元素呈显著正相关(P<0.05),结果表明部分指标可以反映出与之相关的其它指标的增减趋势,相关性越强,趋势越明显。

表3 25个桑树种质桑叶品质指标相关性分析Table 3 Correlation analysis of quality indexes of 25 mulberry germplasm and varietles

2.3 25个不同桑树种质桑叶品质指标因子分析

对25个桑种质桑叶的7个品质指标采用因子分析法,得出各项指标的特征值、累计贡献率、主成分矩阵(表4)。由表4可知,从7项桑叶品质指标中提取出了前4个公因子,4个的累计贡献率达到了74.96%,表明提取的这4个公因子能良好的反映自变量的绝大部分信息,故选取前4个特征值作为综合性指标。由表4可知,第1公因子中在和较高且有正向影响的指标为粗蛋白、Cu、Zn元素含量,载荷权数分别为0.749、0.800和0.806。第1公因子的方差贡献率为28.85%,对桑叶的综合品质影响最大。第2公因子中载荷值较大且有正向影响的指标为纤维素和As元素含量,载荷权数分别为0.726和0.755,第2公因子的方差贡献率为19.61%,对桑叶的综合品质同有较大影响。第3公因子中载荷值较大的指标为Pb元素含量,方差贡献率为13.73%,载荷权数为0.931。第4公因子中载荷值较大的指标为Cd元素含量,方差贡献率12.77%,载荷权数为0.982,为正影响指标。

表4 25个品种桑叶综合品质评价因子的 特征值及累计贡献率Table 4 Characteristic values and cumulative contribution rate of comprehensive quality evaluation factors for 25 varieties of mulberry leaves

经因子分析法计算得出的25个桑种质桑叶样品综合品质的公因子得分和相应的累计贡献率,分别利用式(3)计算,最后得出个桑叶样品品质的综合得分,并进行排序。由表5可知,25个桑种质桑叶中“廉选”5号、007、009三个桑叶品种综合评价得分位列前3名,其桑品种均可开发用于食用桑、药用桑的桑种质资源。

表5 25个桑品种品质因子分析综合得分Table 5 Comprehensive scores of quality factors analysis of 25 mulberry varieties

2.4 桑叶农药残留测定结果分析

本研究测定了有机氯、有机磷、氨基甲酸酯共71种农药的残留量,由于种类过多,所以此处仅选用部分含有检测样品指标的有机氯、有机磷农药混合标准相关表格(表6、表7)。

表6 有机氯农药的气相色谱监测表Table 6 Gas chromatographic monitoringTable for organochlorine pesticides

表7 有机磷农药的气相色谱监测表Table 7 Gas chromatographic monitoringTable for organophosphorus pesticides

2.4.1 检出限及线性关系 将待测农药混合标准储备液按上述方法配制成标准工作液,按选定的方法分析,以峰面积对浓度作标准曲线,结果表明农药的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,决定系数均大于0.99(表8)。

表8 部分农药的线性方程及相关系数Table 8 Linear equations of partial pesticide

2.4.2 准确度和精密度 向桑叶样品中添加0.05、0.1 mg/kg农药标准品,采用外标法定量,定量限为0.006～0.010 mg/kg,相对标准偏差为3.7%～5.2%(n=3),回收率为76%～103%(表9)。

表9 检测方法的定量限、相对标准偏差和回收率Table 9 Quantification limits,relative standard deviations and recovery rates of the test methods

经检测,样品中仅有样品001、桂桑优62、沙2X伦109、“廉选”5号、007、特优2号六个样品检测出有机氯农药残留,其中样品001含有联苯菊酯,残留浓度0.06 mg/kg;样品桂桑优62含有联苯菊酯,残留浓度0.04 mg/kg;样品沙2X伦109含有联苯菊酯,残留浓度0.017 mg/kg;样品“廉选”5号含有氯氟氰菊酯,残留浓度0.027 mg/kg;样品007含有氯氟氰菊酯,残留浓度0.44 mg/kg;样品特优2号含有六氯苯,残留浓度0.001 mg/kg;上述六个样品中的有机氯农药残留量,均未超过GB 2763-2016中国家标准要求的叶类有机氯农药残留的最大检测浓度。通过气相色谱仪检测,仅有样品抗青283检测出有机磷农药——毒死蜱,残留浓度为0.02 mg/kg,其所含的毒死蜱残留量,未超过GB2763-2016中国家标准要求叶类食品有机磷农药残留的最大检测量。

3 结论

本研究将不同指标的原始数据标准化,统一转化为0～1的标准化数据,再经旋转使提取出的公因子更具可解释性。针对桑叶的主要营养成分及重金属元素等7个指标进行检测分析,通过计算公因子累计贡献率和因子得分得到各桑品种桑叶品质综合得分。并对桑叶样品的农残检出量进行判定,结果显示所有样品的农药检出量均未超出GB 2763-2016《中国家标准要求叶类食品农药残留最大检出量》[33]。本研究对25个不同品种桑叶的品质进行综合评价,根据评价检测结果及其农药残留量,最终得出符合国家食品安全标准综合评分位列前三的桑叶品种分别为“廉选”5号、007、009。“廉选”5号品种桑叶的采样点位于海南省儋州市质圃样点,该品种发芽能力强、生长旺盛、节间密、叶肉厚、产叶量高、叶质较优,因此,“廉选”5号是这25种桑叶品种中开发食用、药用的最佳候选品种。经上述方法得到的评价结果,可为筛选不同用途的桑叶资源提供理论依据,对海南省开发桑业蚕业可持续发展具有指导意义。