信阳毛尖茶末多糖的分离纯化和体外抗氧化活性研究

吴金松,耿广威,陈晓培,丁德刚,徐 军,王建玲

(河南牧业经济学院,河南郑州 450046)

信阳毛尖是中国四大名茶之一,因其茶叶茸毛微微可见、峰尖独特而誉名为“毛尖”,又因口感绝佳而备受人们的欢迎[1]。信阳毛尖富含蛋白质、多酚类、糖类、有机酸和维生素矿物质等营养成分[2]。信阳毛尖具有降低人体胆固醇、抗菌消炎、抑制细胞癌变或者基因突变等功效[3-4]。

目前在茶叶加工和使用过程还有大量副产品,如枝叶和灰末等未被利用[5],且人们对信阳毛尖这种绿茶的使用只停留在单纯的冲泡阶段,这使得其中大量的活性成分如氨基酸、糖类和维生素等[6]以及水溶性矿物质得不到有效的利用,造成了资源的浪费。因此,对碎茶叶末中分离纯化出信阳毛尖茶多糖并进行抗氧化活性研究不仅可以大大提高废弃茶叶末资源的利用率,而且具有重要的科研意义。

信阳毛尖茶末多糖的提取方法主要有水提醇沉法、酶提取法、酸碱提取法、超声提取法、微波辅助萃取法以及多种辅助提取相结合法等[7-12]。活性多糖的分级过程主要包括乙醇沉淀分级、季铵盐沉淀分级、金属盐沉淀法分级和DEAE-纤维素凝胶色谱分离等方法[13-16]。通常一次分级纯化很难达到理想的分离效果,本实验通过乙醇沉淀分级粗提和DEAE-纤维素以及 Sephadex-100葡聚糖凝胶色谱分离相结合的方法纯化出主要洗脱组分,结合紫外扫描和凝胶过滤法进行纯度鉴定,红外光谱扫描法对多糖组分进行定性分析,最后进行DPPH自由基、羟自由基以及还原力的测定等体外抗氧化活性研究,以期为信阳毛尖茶叶末废弃材料的再利用以及功能食品添加剂的研究开发提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

信阳毛尖茶叶末(产地为河南信阳浉河区,生产日期2018年9月) 购于郑州北区茶叶城;苯酚、硫酸、盐酸、氢氧化钠、氯化钠 以上试剂均为分析纯,洛阳市化学试剂厂;葡萄糖 分析纯，南京森贝伽生物科技有限公司;无水乙醇、甲醇、水杨酸、硫酸亚铁、双氧水、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、抗坏血酸VC均为分析纯,天津科密欧化学试剂有限公司;1,1-二苯基-2-苦味基肼(DPPH) 分析纯,成都化夏化学试剂有限公司;DEAE-52纤维素、Sephadex-100、Sephadex-150、各种标准葡聚糖和蓝色葡聚糖(Dextran T-2000) 北京索莱宝科技有限公司。

玻璃层析柱(Φ2.6 cm×40 cm、Φ2.6 cm×60 cm) 郑州赛克斯玻璃仪器公司;Kd723型可见光分光光度计 上海美析仪器有限公司;FA2204B型分析天平 上海佑科仪器仪表有限公司;101-1型恒温鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;RE-52C型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器有限公司;SHZ-III循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;UV1902型双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;Nicolet iS10型傅立叶变换红外光谱仪 美国尼高力公司。

1.2 实验方法

1.2.1 信阳毛尖茶末多糖提取工艺 首先取信阳毛尖茶叶样品进行干燥(55 ℃恒温干燥),研碎后过100目筛),然后进行索氏提取器连续抽提脱脂处理,再进行烘干;精确称取5.0 g样品，以料液比1∶30于85 ℃水浴锅中浸提,滤液抽滤后浓缩,再低温静置(4 ℃,12 h)醇沉(同体积提取液加入不同比例的无水乙醇使之产生不同的乙醇终浓度),再进行减压过滤、同浓度乙醇抽洗于55 ℃烘箱中干燥至恒重,即得到信阳毛尖茶末粗多糖[14]

1.2.2 不同乙醇终浓度对信阳毛尖茶末粗多糖得率的影响 由于多糖提取液在不同的乙醇终浓度条件下沉淀后得率不同,因此在等体积的提取液中加入不同体积的无水乙醇,使之产生不同的乙醇终浓度(乙醇终浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%)提取多糖,考查乙醇终浓度对信阳毛尖多糖得率的影响。

1.2.3 信阳毛尖茶末多糖得率的测定 将不同乙醇终浓度提取到的粗多糖样品研碎后分别称取20.0 mg，用蒸馏水定容至250 mL容量瓶中,分别用吸量管量取1.0 mL样液于试管中,蒸馏水做空白样,采用苯酚-硫酸法测定其吸光度,代入葡萄糖标准曲线中的线性回归方程y=0.0093x+0.0149,R2=0.9995,从而计算出不同乙醇终浓度下的信阳毛尖茶末多糖得率[17]。信阳毛尖粗多糖得率的计算公式计算如下:

式中:C:为样品葡萄糖浓度(μg/mL);V:为信阳毛尖多糖溶液总体积(mL);D:为稀释倍数;M:为信阳毛尖粉质量(g)。

测定出最佳得率下的乙醇浓度后,用该浓度的乙醇对信阳毛尖茶末多糖进行大量提取备用。

1.2.4 信阳毛尖茶末多糖的分离纯化 取乙醇最佳提取终浓度提取到的粗多糖样品200 mg,用少量蒸馏水溶解后上DEAE-52纤维素柱分级,依次使用蒸馏水、0.05、0.10、0.20、0.50 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱,根据洗脱峰进行命名。用试管收集洗脱液时4 mL/管,然后从每支试管中用吸量管吸取1.0 mL,采用苯酚-硫酸法于490 nm处测定其吸光度值,记录数据并绘制洗脱曲线图,得到的主要洗脱组分再用纯水、0.20、0.50 mol/L的NaCl溶液经过Sephadex-G100葡聚糖凝胶进行梯度洗脱二次分级纯化[14],纯化后各组分得率计算公式如下[17-18]:

式中,M组分是吸光度大于0.1各管数洗脱液收集后浓缩冷冻干燥后的质量(mg);M进样为进样量(mg)。

1.2.5 信阳毛尖茶末多糖组分的纯度鉴定

1.2.5.1 凝胶过滤法 分别取Sephadex-100葡聚糖凝胶分级纯化后的主要组分,溶解后上Sephadex-150葡聚糖凝胶层析柱,以蒸馏水为洗脱液,收集洗脱液4 mL/管,通过苯酚硫酸法跟踪检测,每管洗脱液以490 nm波长处吸光度对洗脱液管数,做洗脱曲线图,根据洗脱曲线是否呈单一对称峰,判断其纯度大小[14]。

1.2.5.2 紫外光谱扫描法 将分离纯化到的信阳毛尖茶末多糖组分配制成1.0 mg/mL的溶液,在紫外可见分光光度计进行全波段扫描(190～400 nm),根据紫外扫描图谱在260～280 nm波长处是否出现吸收峰,进而确定分离纯化出的信阳毛尖茶叶末多糖组分中是否含有蛋白质、核酸等大分子物质[19]。

1.2.6 信阳毛尖多糖分子量Mr的测定 采用葡聚糖凝胶过滤法(GPC)[14],SephadexG-100湿法装柱,层析柱规格为60 cm×2.6 cm,纯水平衡12 h。洗脱速度0.5 mL/min,洗脱液采用蒸馏水。各标准葡聚糖和蓝色葡聚糖(Dextran T-2000)上样量均为2.0 mg,首先用蓝色葡聚糖测得洗脱体积为V0,然后用型号T-110、T-70、T-40、T-10标准葡聚糖相继上柱。手动分管收集洗脱液,每管3 mL,苯酚-硫酸法跟踪检测,根据吸光度测定洗脱体积Ve。以Ve/V0为纵坐标,分子量的自然对数lgMr为横坐标,绘制标准曲线,该标准曲线的回归方程是:(Ve/V0)=-1.4384(lgMr)+8.1382,R2=0.9988。在同样洗脱条件下,取纯化后的多糖2.0 mg上柱,测定各自的洗脱体积Ve′,结合标准曲线和Ve′/V0值计算出相应的分子量。

1.2.7 信阳毛尖茶末多糖的红外光谱扫描 称取少量经纯化干燥后的多糖组分XPS-5B与溴化钾充分研磨混合后制成压片,放入红外光谱仪中进行波谱扫描,根据红外扫描谱图出峰位置及峰面积的大小,对该分离纯化后组分是否具有多糖结构进行定性分析[20]。

1.2.8 信阳毛尖茶末多糖的抗氧化活性

1.2.8.1 DPPH自由基清除率的测定 配制出0.20～1.20 mg/mL信阳毛尖粗多糖、纯化后的多糖组分XPS-5B和VC样品溶液,同时配制0.125 mmol/L的DPPH甲醇溶液。取一支试管,向其中加入2.0 mL多糖溶液后,再加入2.0 mL 0.125 mmol/L DPPH的甲醇溶液,充分振荡后,于室温下暗处反应30 min。在波长517 nm处,使用无水甲醇调零后测定其吸光度(A)。同等条件下,对照组(Ab)为2.0 mL多糖溶液和1.0 mL的无水甲醇,空白组(A0)为2.0 mL的无水甲醇和1.0 mL的DPPH溶液[21-22]。测定完成后,按照式(1)计算不同浓度的多糖溶液对DPPH自由基的清除率:

式(1)

1.2.8.2 羟自由基清除率的测定 将不同浓度的多糖溶液2.0 mL分别放入不同的试管中并做好标记,再逐一加入2.0 mL 6 mmol/L的 FeSO4溶液,2.0 mL 6 mmol/L的H2O2溶液,将其充分摇匀,并于室温下静置10 min,之后将2.0 mL新配制的6 mmol/L水杨酸的乙醇溶液加入其中,并混合均匀,在37 ℃下反应30 min后,波长设置为510 nm，测定它们的吸光度(Ax)。与此同时,样品对照组实验使用相同体积的乙醇来替代水杨酸溶液(Ay);空白对照组则使用相同体积的蒸馏水替代多糖溶液(Az),在相同的条件下测定其吸光度值[23-24]。测定完成后,按照式(2)计算各浓度多糖溶液对羟自由基的清除率:

式(2)

1.2.8.3 还原力的测定 分别取1.0 mL各浓度的多糖溶液于不同试管中将2.5 mL pH=6.6、0.2 mol/L的磷酸缓冲溶液加入其中,再加入2.5 mL的1 g/100 mL的K3Fe(CN)6溶液,充分混匀,并在50 ℃的条件下水浴20 min,取出后迅速将其放入冷水中冷却,同时再加入2.5 mL10 g/100 mL的三氯乙酸溶液,混合摇匀。将样品放入离心机中,在5000 r/min的条件下离心5 min,吸取1.5 mL反应液至试管中,加入0.2 mL新配制的0.1 g/100 mL的FeCl3水溶液,再加入1.0 mL蒸馏水混合均匀,在暗处反应30 min。用蒸馏水校零后,在700 nm波长处测定各试样的吸光度值[25],记录数据。

1.3 实验处理

使用Origin 8.6和Excel进行图表的绘制和相关数据的处理。

2 结果与分析

2.1 不同乙醇终浓度沉淀信阳毛尖茶末粗多糖的得率

由图1可知,信阳毛尖茶末粗多糖的得率随着乙醇终浓度的升高而增大,当乙醇浓度达到最大90% 时信阳毛尖茶末粗多糖分级沉淀的得率最高,为2.47%,因此本实验选用90%的乙醇终浓度分级沉淀提取的信阳毛尖茶末粗多糖进行后续的分离纯化。

图1 不同乙醇终浓度对信阳毛尖茶末粗多糖的得率Fig.1 Extraction rate of polysaccharide from Xinyangmaojian tea dust at the end of different ethanol concentrations

2.2 不同浓度的洗脱液对信阳毛尖茶末粗多糖样品的分级纯化

由图2可知,不同浓度的洗脱液对信阳毛尖茶末粗多糖样品均有一定的洗脱效果,将洗脱下来的多糖组分按照洗脱液浓度大小分别命名为XPS-1、TPS-2、XPS-3、XPS-4、XPS-5分别收集各吸收峰的洗脱液经过旋转蒸发冷冻干燥,计算出各组分的得率分别为7.9%、9.2%、11.8%、16.7%、50.6%。由于XPS-1、XPS-2、XPS-3、XPS-4得率太低,因此选择洗脱组分XPS-5进行Sephadex-100葡聚糖凝胶纯化。

图2 信阳毛尖茶末多糖DEAE-52纤维素层析柱洗脱曲线Fig.2 Elution curve of DEAE-52 cellulose column of Xinyangmaojiao tea dust polysaccharide

2.3 XPS-5的Sephadex-100葡聚糖凝胶洗脱曲线

由图3可知,经过DEAE-52纤维素分级纯化后的组分XPS-5,洗脱后得到XPS-5A、XPS-5B和XPS-5C三种多糖组分,其得率分别为6.8%、59.2%、6.4%;由于XPS-5A、和XPS-5C得率太低,所以本研究选择得率最高的XPS-5B进行后续的定性分析和体外抗氧化活性实验。

图3 多糖组分XPS-5 Sephadex-100葡聚糖凝胶洗脱曲线Fig.3 The elution curves of XPS-5 Sephadex-100 chromatographic column

2.4 信阳毛尖茶叶末多糖组分XPS-5B的紫外扫描图谱

由图4可知,XPS-5B经纯水洗脱后,洗脱曲线呈单一对称峰,说明经过DEAE-52纤维素和Sephadex-G100分级纯化后的主要组分XPS-5B纯度较高。由图5可知,XPS-5B在260～280 nm波长段处,信阳毛尖茶叶末多糖组分XPS-5B无明显吸收峰,因而纯化后的信阳毛尖茶末多糖组分XPS-5B样品中不含或含有极少量蛋白质或核酸,结合凝胶过滤洗脱曲线和测定多糖含量,测定XPS-5B纯度为92.4%,纯度较高。

图4 组分XPS-5B Sephadex-150葡聚糖凝胶洗脱曲线Fig.4 Elution curves of XPS-5B Sephadex-150 chromatographic column

图5 组分XPS-5B的紫外扫描光谱图Fig.5 Ultraviolet scanning spectra of component XPS-5B

2.5 信阳毛尖多糖组分分子量Mr结果分析

由图6可知,分别收集XPS-5B吸光度大于0.1的管数为23～37管,洗脱体积Ve分为45 mL。已测得标准蓝色葡聚糖外水体积V0为30 mL,根据Ve′/V0值,计算其分子量为41208 Da。

图6 XPS-5B SephadexG-100洗脱曲线Fig.6 SephadexG-100 elution curve of XPS-5B

2.6 信阳毛尖茶叶末多糖组分XPS-5B的红外扫描图谱

从图7中可以看出,组分XPS-5B在波数3424 cm-1产生的-OH伸缩振动吸收峰,在2942 cm-1处产生的C-H伸缩振动吸收峰,在1647 cm-1处产生的羰基伸缩振动吸收峰,在1442 cm-1及1019 cm-1处产生的-OH弯曲振动吸收峰,在800 cm-1处产生的β-型糖苷键吸收峰[19,26-27]。由红外吸收图谱可知,信阳毛尖茶末多糖组分XPS-5B符合活性植物多糖结构特征,为β-型糖多糖。

图7 组分XPS-5B的红外扫描图谱Fig.7 Infrared scanning map of component XPS-5B

2.7 信阳毛尖茶末多糖组分XPS-5B抗氧化活性测定结果

2.7.1 信阳毛尖茶末多糖组分XPS-5B DPPH自由基清除率 由图8可知,在茶末多糖质量浓度0.20～1.20 mg/mL范围内,信阳毛尖纯化后的组分XPS-5B和粗多糖的DPPH自由基清除率随着质量浓度的不断增加而增加,即DPPH自由基的清除率与质量浓度呈正相关。纯化得到的毛尖多糖组分XPS-5B在各质量浓度下,DPPH自由基清除率显著强于未纯化的毛尖粗多糖(P<0.05),因而达到了理想的分离纯化效果;当其浓度为1.20 mg/mL时DPPH自由基清除率达到89.18%,与VC对照组接近,由此说明纯化后的信阳毛尖多糖组分XPS-5B具有较强的DPPH自由基清除效果。

图8 不同质量浓度茶多糖对DPPH自由基清除率的影响Fig.8 Effects of different concentrations of tea polysaccharides on DPPH radical scavenging rate

2.7.2 信阳毛尖茶末多糖组分XPS-5B 羟自由基清除率 由图9可知,在茶末多糖质量浓度0.20～1.20 mg/mL范围内,信阳毛尖纯化后的组分XPS-5B和未纯化粗多糖的羟自由基清除率随着质量浓度的不断增加而增加,即羟自由基的清除率与质量浓度呈正相关。纯化后的毛尖多糖组分XPS-5B在各质量浓度下,羟自由基清除率显著强于未纯化的毛尖粗多糖(P<0.05),因而达到了理想的分离纯化效果。当其浓度为1.20 mg/mL时 羟自由基清除率达到90.62%,与VC对照组接近,与丁世环等[28]粗提的茶多糖在3.2 mg/mL对羟自由基的清除率最高可达60.37%相比,纯化后的信阳毛尖多糖组分XPS-5B具有较强的羟自由基清除能力。

图9 不同质量浓度茶多糖对羟自由基清除率的影响Fig.9 Effects of different concentrations of tea polysaccharides on hydroxyl radical clearance

2.7.3 信阳毛尖茶末多糖组分XPS-5B 的还原力 根据总还原力测定法,吸光度值的变化大小反映出样品总还原力的高低,吸光度越大,则样品的还原力就越强[29-30]。由图10可知,在茶末多糖质量浓度0.20～1.20 mg/mL范围内,信阳毛尖纯化后的多糖组分XPS-5B和粗多糖的还原力随着质量浓度的不断增加而增加,即还原力与质量浓度呈正相关。纯化后的毛尖多糖组分XPS-5B在各质量浓度下,还原力的吸光度显著高于未纯化的毛尖粗多糖(P>0.05),达到了理想的分离纯化效果;当其浓度为1.20 mg/mL时 XPS-5B还原力吸光度为0.536,与VC对照组相近。

DPPH自由基、羟自由基清除率以及还原力大小是判断其抗氧化活性的重要指标。结合图8～图10分析可知XPS-5B、毛尖粗多糖的抗氧化活性大小与其浓度大小均呈依赖效应,而同浓度的XPS-5B的DPPH自由基和羟自由基清除率、还原力吸光度均显著大于毛尖粗多糖(P<0.05);0.80 mg/mL的信阳毛尖茶末多糖羟自由基率为61.82%,与曾桥等[31]0.875 mg/mL的杜仲叶茯砖茶多糖对羟自由基清除率为43.97%相比,说明分离纯化后的信阳毛尖茶多糖XPS-5B具有较强的抗氧化性。

图10 不同质量浓度茶多糖对还原力的影响Fig.10 Effects of different concentrations of tea polysaccharides on reducing power

3 结论

利用不同的乙醇终浓度分级粗提,当乙醇终浓度为90%时,信阳毛尖茶末粗多糖的得率最高,为2.47%。DEAE纤维素阴离子交换柱进行梯度洗脱,分级纯化出以0.50 mol/L的NaCl溶液洗脱的主要组分XPS-5,再进行Sephadex-100葡聚糖凝胶分级得到主要洗脱组分XPS-5B。XPS-5B纯度鉴定结果表明其基本不含蛋白质和核酸,纯度到达了92.4%,分离纯化效果较好。分子量测定大小为41208 Da。红外光谱扫描表明XPS-5B符合活性植物多糖结构特征,为β-型糖苷键多糖。XPS-5B体外抗氧化活性测定结果表明,当XPS-5B浓度为1.20 mg/mL时对DPPH自由基和羟自由基的清除率分别为89.18%、90.62%,总还原力吸光值为0.536,与未纯化的毛尖粗多糖相比,具有较强的抗氧化活性。本研究为信阳毛尖茶末废弃资源的再利用以及功能产品的研究开发提供一定的理论依据。由于本研究仅对分离纯化后的信阳毛尖茶末多糖进行了构型分析、分子量大小以及体外抗氧化活性测定,有关信阳毛尖茶末多糖的单糖分子组成、糖苷键等结构分析以及降低胆固醇、抑制肿瘤等其他生物活性有待进一步的研究。