“提取、测定茶叶中咖啡因”综合性实验项目的设计

张艳军，廖日权，王 芸，钟书明，张瑞瑞，陈 怡

(北部湾大学 石油与化工学院，广西 钦州 535000)

1 引言

咖啡因是一种生物碱，能溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，存在于茶叶中[1-2]。“从茶叶中提取咖啡因”是有机化学实验课程中开设的一个实验性项目，实验利用索氏提取法对天然产物中有效成分进行提取[3]。在索氏抽提过程中判断提取是否完全主要看颜色的变化，不同的学生判断标准不一样，无法准确判断抽提是否完成；最后通过升华得到纯品，由于升华过程中温度控制难度比较大，可能会最终导致得到咖啡因量少，无法准确得到其中咖啡因的含量[4-5]。而“高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因含量”是仪器分析实验中的一个实验项目，利用高效液相色谱仪对天然产物有效成分的含量进行测定[6]。通过把二个实验相结合，设计成一个综合性实验，该综合实验的开设使学生能够掌握天然产物有效成分的提取工艺和含量测定。开设综合性设计性实验有助于锻炼学生的创新思维、创新能力及综合素质的培养[7-8]。索氏提取工艺设计通过设定溶剂浓度、提取时间、提取温度、溶剂用量等因素，采取单因素和正交试验考察这些因素对咖啡因得率的影响[9]，利用HPLC法检测咖啡因含量。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

高效液相色谱仪1260 (美国安捷伦)，色谱柱：ODS-C18柱 (4.6×250mm，5μm)，甲醇为色谱纯(fisher公司)。

2.2 标准曲线的绘制

称取升华实验获取咖啡因(色谱纯)标准品20mg于100mL容量瓶中，用甲醇溶解配制成(200μg/mL)咖啡因标准储备液，分别吸取0.1，0.5，1.0，2.0，5.0mL储备液于10mL容量瓶中，配制成浓度为2，10，20，40，100μg/mL的标准曲线系列溶液，以标准工作液的质量浓度(x)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标，绘制出咖啡因标准工作曲线[10]。

2.3 咖啡因得率计算

精密吸取咖啡因提取液0.5mL于10mL容量瓶中，以同浓度乙醇进行定容混匀后，设定流动相甲醇∶水=40∶60，紫外检测器波长280nm，柱温为30℃的条件下测定其提取液的峰面积，平行测定三次取平均值。根据测得的峰面积及咖啡因标准工作曲线由公式(1)计算得到样品液中咖啡因的得率。

样品中咖啡因得率按公式(1)计算：

咖啡因得率= (N×C×V)/M×100%

(1)

式子中N为咖啡因提取液的稀释倍数；C为咖啡因提取液的质量浓度(μg/mL)；V为咖啡因提取液稀释前的总体积(mL)；M为茶叶的质量(g)。

2.4 实验方法

2.4.1 单因素实验

HPLC法测定，以咖啡因得率为参考指标，通过研究提取温度、提取时间、溶剂浓度、料液比各因素条件的改变对咖啡因得率的影响，得出最佳提取工艺条件，具体单因素设定如下：

(1)提取温度对咖啡因得率的影响：提取时间2h、溶剂浓度90%、料液比1∶50作为固定条件保持不变。分别设定提取温度60，70，80，90，100 ℃这五个水平来实验。判断提取温度对咖啡因得率的影响。

(2)提取时间对咖啡因得率的影响：最佳提取温度、溶剂浓度90%、料液比1∶50作为固定条件保持不变。分别设定提取时间1，2，3，4，5这五个水平来实验。判断提取时间的不同对咖啡因得率的影响。

(3)溶剂浓度对咖啡因得率的影响：最佳提取温度、最佳提取时间、料液比1∶50作为固定条件不变。分别设定溶剂浓度60%，70%，80%，90%，100%这五个水平来实验。判断溶剂浓度的不同对咖啡因得率的影响。

(4)料液比对咖啡因得率的影响：以最佳提取温度、提取时间、溶剂浓度作为固定条件不变。分别设定料液比1∶45，1∶50，1∶55，1∶60，1:65g/mL这五个水平来实验，判断料液比的不同对咖啡因得率的影响。

2.4.2 正交试验

根据单因素结果，设计正交试验法获取最佳提取工艺条件。根据提取温度、提取时间、溶剂浓度、料液比、设计四因素三水平正交试验，采用L9(34)正交表进行试验，根据正交试验数据分析得出咖啡因的最佳提取工艺参数。

3 结果与讨论

3.1 咖啡因标准曲线

利用HPLC，得到咖啡因标准曲线如图1所示，线性方程为y = 22.83x +2.9903，R2=0.9994。在咖啡因2～100μg/mL的浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。

图1 咖啡因标准曲线

3.2 单因素实验结果分析

3.2.1 提取温度对咖啡因得率的影响

如图2所知，在提取温度为60～90℃时，咖啡因得率逐渐增大，这说明适当的温度提升有利于咖啡因加速溶解；当提取温度达到90℃，咖啡因得率达到最佳；若提取温度继续升高至100℃时，得率出现明显降低，此时醇溶性杂质由于过高温度而大量溶出[11]，与咖啡因竞争溶于乙醇-水体系，从而干扰咖啡因溶解。并且温度过高，加速了溶剂乙醇的挥发。故此，得到最佳提取温度为90℃。

图2 提取温度对咖啡因得率的影响

3.2.2 提取时间对咖啡因得率的影响

如图3所示，当提取时间在3h内，咖啡因的得率保持上升；当提取时间为3h，咖啡因的得率呈最大，达1.77%；但超过3h后，得率反而下降。这可能是因为提取时间过短，溶液中咖啡因未溶解平衡，溶解较少，得率低；若提取时间过长，咖啡因易发生分解及其他损失，得率也会降低，由此可确定得到最佳提取时间为3h。

图3 提取时间对咖啡因得率的影响

3.2.3 溶剂浓度对咖啡因得率的影响

如图4所示，当溶剂浓度在60%～90%范围内时，咖啡因的得率呈增长趋势；溶剂浓度为90%时，咖啡因得率最大，因为咖啡因为非极性小分子化合物，基于相似相溶原理，咖啡因的溶解度随着乙醇浓度的提高而提高；但当溶剂浓度为100%时，咖啡因的提取率明显降低，无水热乙醇更易挥发导致溶剂的减少，咖啡因的溶解度因此下降。故而确定乙醇90%为最佳溶剂浓度。

图4 乙醇浓度对咖啡因得率的影响

3.2.4 料液比对咖啡因得率的影响

如图5所示，随着料液比的增加，咖啡因的得率显著提高，当料液比达到1∶55时，此时咖啡因得率达到2.12%；但若料液比继续增加时，咖啡因的得率无明显变化。这是因为料液比较小时，提取液中咖啡因浓度较大，由于分子扩散速度低导致咖啡因得率小，随着溶剂量的提高，茶叶中更多的咖啡因被溶解释放出来，但茶叶中所含的咖啡因是一定的，多数咖啡因被析出之后溶剂量的再增加对最终提取效果影响不大。基于提取效果及经济成本的角度出发，可以确定最佳料液比为1∶55。

图5 料液比对咖啡因得率的影响

3.3 正交试验结果

本实验考察四个因素和三个水平，故此选择L9(34)进行正交试验。实验设计及结果由表1、表2所示。

表1 L9(34)正交表

表2 正交试验结果及分析表

由表2中K值分析确定得到提取咖啡因的最佳组合A2B2C2D2，由R值确定上述因素在咖啡因提取实验中的影响次序为提取温度>料液比>提取时间>溶剂浓度，本实验最佳提取条件为：提取温度90 ℃，提取时间3 h，溶剂浓度90%，料液比1∶55 (g/mL)，该条件下咖啡因得率达2.13%。

4 结语

将有机化学实验“咖啡因的提取”和仪器分析实验“咖啡因的测定”实验教学内容相结合，既形成一个系统的、完整的实验过程，又体现出有机化学与仪器分析之间的交叉融合。使学生掌握有机化学中天然产物的提取同时，也掌握了液相色谱仪对有机物的定性、定量分析，对液相色谱仪的结构、原理及用途有了更直观的认识。综合性实验教学内容的设计，可培养学生多角度思考问题、开拓学生的思维。有助于学生综合解决问题能力、创新能力等综合素质培养，同时也为学生今后开展科学研究提供思路。