HPLC-DAD法同时测定柴黄颗粒中5种成分的含量

杜明珏，蔡建红，钱 丽，侯剑秋

0 引言

柴黄颗粒是由柴胡药材和黄芩提取物组成的中药成方制剂，收录于国家食品药品监督管理局国家药品标准中。柴胡退热解郁、疏肝，黄芩清热泻火、燥湿解毒，二者合用在临床上主要用于上呼吸道感染引起的感冒发热等症状[1-4]。根据中药质量标志物(Q-Mark)的概念，现代药理研究表明，柴胡中发挥抗病毒、抗炎等作用的主要活性物质为柴胡皂苷类[5]，黄芩提取物中的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷等主要成分具有清热抑菌、抗炎解毒的作用[6]，与该药的药理作用一致。目前对于柴胡皂苷的测定[7-9]主要采用HPLC、HPLC-ELSD和HPLC-MS法。由于柴胡皂苷是末端吸收，紫外吸收弱，因此，HPLC-UV法检测时灵敏度低、干扰大。黄芩中的几种黄酮苷类和苷元主要是通过HPLC梯度洗脱进行测定[10-11]。目前，柴黄颗粒的质量控制只有标准中的薄层色谱法鉴别和黄芩苷的含量测定。此外，已有相关报道，包括HPLC法测定柴黄颗粒中的黄芩苷含量[12-13]，红外光谱法建立柴黄颗粒的指纹图谱[14]，HPLC法同时测定柴黄颗粒中柴黄皂苷a、b1、c、d及黄芩苷的含量[15]，柴黄颗粒中总皂苷的测定[16]等，尚无对该药中黄芩提取物中多成分含量的同时测定。因此，笔者参考文献报道[17-18]，基于黄芩在处方中的作用，拟增加黄芩提取物中的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素以及柴胡药材中柴胡皂苷a成分的含量测定，从而更加全面地控制柴黄颗粒的质量，为有效评价柴黄颗粒的质量提供依据。

1 仪器与试药

Waters2695高效液相色谱仪(美国Waters仪器公司)；Empower3 工作站；Waters2996 DAD检测器，Mettler AE240分析电子天平(瑞士Mettler公司)；KQ-700VDB型双频数控超声波清洗器(江苏昆山超声仪器公司)；柴黄颗粒(河南灵佑药业有限公司，规格：4 g/袋)，批号：180802、181103、190102，对照品：黄芩苷(批号：110715-201516，质量分数94.0%)、黄芩素(批号：111595-201608，质量分数97.9%)、汉黄芩苷(批号：112002-201602，质量分数98.5%)、汉黄芩素(批号：111514-201706，质量分数100%)、柴胡皂苷a(批号：110777-201711，质量分数91.1%)，均购于中国食品药品检定研究院，乙腈为色谱纯(美国Merck公司)，水为超纯水(美国Mili-Q超纯水机)；磷酸、甲醇等均为分析纯(上海国药集团化学试剂公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Gemini-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱，0～15 min(15%～40%A)，15～25 min (40%～40%A)，25～50 min (50%～80%A)；流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm (0～20 min)，210 nm (20～26 min)，280 nm (26～50 min)；进样量：10 μl。在上述色谱条件下分别测定对照品、供试品溶液及阴性样品溶液，色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取黄芩苷对照品10.16 mg、汉黄芩苷5.73 mg置同一50 ml容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，作为对照品储备溶液Ⅰ；另精密称取黄芩素9.82 mg、汉黄芩素4.58 mg置同一50 ml容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，作为对照品储备溶液Ⅱ；精密称取柴胡皂苷a对照品2.16 mg置10 ml容量瓶中，分别精密加入上述对照品储备溶液Ⅰ 3 ml和对照品储备溶液Ⅱ 1 ml，加50%甲醇稀释至刻度作为对照品混合溶液(每1 ml含黄芩苷60.96 μg、汉黄芩苷34.38 μg、黄芩素19.64 μg、汉黄芩素9.16 μg、柴胡皂苷a 216 μg)。

2.2.2 供试品溶液的制备 取柴黄颗粒2袋，混匀研细，精密称取上述粉末0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，称定重量，超声处理30 min (频率40 kHz，功率270 W)，取出，放冷，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用直径0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品的制备 按照柴黄颗粒处方量的1/10，分别制备缺柴胡药材和黄芩提取物的阴性样品，按照“2.2”项下的供试品溶液制备方法制备。

2.3 专属性试验 取上述3种溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定，结果表明，阴性样品对柴黄颗粒中5个成分的测定无干扰，见图1。

2.4 标准曲线的测定 精密吸取上述“2.2.1”项下的对照品混合溶液1 ml，共5份，分别置100 ml、50 ml、25 ml、10 ml、2 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，分别作为1～5号系列对照品溶液，然后按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，以待测成分进样量的质量(ng)为横坐标、相对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，测定结果见表1。

表1 5种成分的线性方程、相关系数及线性范围

2.5 精密度试验 分别取“2.4”项下的1、3、5号系列对照品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，连续进样6次，进样量10 μl，记录各成分的峰面积，计算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷a的峰面积RSD分别为0.52%、0.66%、1.35%、0.83%、0.38%，结果表明，该仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一批号柴黄颗粒供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12、16、24 h进行测定，进样量10 μl，连续考察24 h，记录各成分的色谱峰面积，结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷a峰面积RSD分别为2.23%、2.07%、2.56%、1.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批号的柴黄颗粒样品，按照“2.3”项下的方法制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，结果显示，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、胡皂苷a的峰面积RSD分别为0.39%、1.03%、1.85%、0.68%、0.52%，表明该方法的重复性良好。

2.8 回收率试验 精密称取已知含量的柴黄颗粒样品0.1 g置具塞锥形瓶中，共6份，另精密称取黄芩苷约10 mg，共6份，分别加入上述供试品溶液中，然后精密称取汉黄芩苷17.08 mg，黄芩素9.36 mg，汉黄芩素3.52 mg，柴胡皂苷a 2.18 mg置同一10 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，作为待加混合标准品溶液，分别精密吸取上述待加标准品溶液1 ml置上述6份供试品溶液中，然后按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行含量测定，分别计算上述5个成分的回收率，结果见表2。

2.9 样品的测定 取3个不同批号的柴黄颗粒样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备，每个批号分别制备3份，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，结果求平均值，分别计算不同批次样品中5个成分的含量，测定结果见表3。

3 讨论

3.1 供试品制备条件选择 笔者采用不同的提取溶剂(水、50%甲醇、甲醇、5%浓氨甲醇)对柴黄颗粒样品溶液制备方法进行考察，结果显示，50%甲醇溶剂和水作为溶剂时，黄芩提取物中黄芩苷、汉黄芩苷的含量较高，黄芩素和汉黄芩素含量稍低，柴黄皂苷的含量在5%浓氨甲醇中含量最高，甲醇次之，最后综合考虑采用50%甲醇溶液作为提取溶剂。本研究对不同超声时间(10 min、30 min、60 min)和不同的超声功率(120 W、280 W、320 W)进行考察，结果显示，超声时间在30 min以上、功率为320 W时各主要成分含量基本变化不大。因此，选择50%提取溶剂、超声时间30 min、超声功率280 W作为供试品溶液的制备方法。

3.2 色谱条件选择 本研究采用梯度洗脱进行多成分的测定，分别采用乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸，对流动相组成进行了考察。结果显示，乙腈-0.1%磷酸作为流动相时，各色谱峰的分离效果优于其他流动相，基线平稳，对称因子较高，拖尾现象减小，最后确定乙腈-0.1%磷酸作为本实验的流动相系统。采用DAD检测器对上述5个共有峰进行光谱扫描，结果显示，黄芩苷在280 nm下具有最大吸收，汉黄芩苷在270 nm下具有最大吸收，黄芩素和汉黄芩素在274 nm下具有最大吸收，柴胡皂苷在208 nm下有最大吸收，因此，采用变换波长进行测定。由于黄芩苷的含量较高，且在280 nm下测定时，汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量与其在最大吸收处几乎没有变化，根据最大吸收，并且参考中国药典，选择210 nm下测定柴胡皂苷，结果显示，干扰较小，色谱峰形良好。因此，选择280 nm和210 nm下进行变换波长测定，从而保证较高的灵敏度。

表2 加样回收率结果

表3 5种成分含量测定结果(mg/g)

3.3 试验结果分析 在配制上述对照品溶液过程中，黄芩中各种对照品不易溶解于甲醇中，尤其是黄芩苷，因其在甲醇中溶解度较低，因此，采用50%甲醇进行对照品的配制，使其快速溶解。此外，在配制各对照品溶液时，建议采用棕色量瓶，制备供试品溶液时也应该尽量避光操作，由于黄芩素不稳定，在储存期间发生分解，因此，在制备和检测过程应尽可能快速分析，最大程度减少黄芩素含量损失。针对黄芩中黄酮类成分酚羟基的影响，笔者在流动相中加入少量酸，对色谱峰的拖尾现象有较好的改善作用，与上述色谱条件考察一致。由于黄芩中4种主要黄酮类成分结构相似，存在相互转换的可能，因此，原标准中仅测定黄芩苷的含量具有一定的片面性。现行标准中规定黄芩苷的含量为每袋黄芩提取物以黄芩苷含量计应为0.30～0.40 g，折合为0.075～0.10 g/g，本实验建立的方法中，3批样品中黄芩苷的含量均符合规定，表明该方法可以用于其含量测定。

4 总结

本文建立了HPLC-DAD法同时测定柴黄颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和柴胡皂苷a含量，比现行标准中仅通过黄芩苷的含量进行控制更能全面、有效地反映药品的质量，且该方法经方法学验证，具有方法简单、专属性强、准确度高的优点。但是该法对于处方中的柴胡成分控制依然较少。由于柴胡主要活性成分为皂苷类，紫外具有末端吸收，且干扰较大，因此，其与黄芩提取物中活性成分同时测定具有很大的困难，希望以后增加HPLC-MS/MS方法，以增加多组分含量同时测定，从而全面控制柴黄颗粒的质量。