金钗石斛植物提取液在化妆品中的应用研究

陈 斌

(上海百雀羚日用化学有限公司第三分公司，上海 201400)

石斛始载于《神农本草经》[1]，性甘，微寒。归胃、肾经，具有益胃生津，滋阴清热的功效。主治热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕等症[2]。

金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)在《中国药典(2015年版)》中列为药用石斛的首要来源[2]。原植物为石斛(Dendrobiumloddigesii，别名吊兰花、扁金钗、小黄草、金钗石斛)、矩唇石斛(D.linawianum，别名金石斛)[3]。“金钗石斛”之名可能最早载于唐代《道藏》之《太上肘后玉经方》[4-5]，《本草纲目》[6]正式将“金钗”作为石斛的别名而收载，并称“其茎状如金钗之股，故古有金钗石斛之称”。

金钗石斛的化学成分主要有生物碱类、多糖类、黄酮类、酚类、香豆素类及甾体糖苷类化合物[7]。生物碱类成分是最早从石斛属植物中分离并进行结构鉴定的化合物[8]。国内外学者对金钗石斛中的生物碱类成分进行了大量的研究，已鉴定出的生物碱以石斛碱、石斛次碱等倍半萜类生物碱为主[9]。金钗石斛多糖类成分含量大约为4%[9]，Luo等[10]从金钗石斛粗多糖中分离出多个组分，主要包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖和少量的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖。此外，从金钗石斛中还分离得到13个酚酸类化合物、15个联苄类化合物、8个菲类化合物和2个芴酮类成分[11-13]。

近年来，金钗石斛在化妆品中应用日益增多，主要集中在保湿、延缓衰老、美白等方面[7]。本研究旨在对以金钗石斛为主要成分的植物复方在化妆品中的应用情况进行研究，为其在化妆品中的应用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

CM 825水分含量测试仪(Courage and khazaka，德国)；VC98皮肤测试仪(Visioscan)；T6新世纪型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；Herocell 180 CO2培养箱(上海润度生物科技有限公司)；CellInsight CX5激光共聚焦显微镜(Thermo fisher scientific)；Varioskan LUX 多功能酶标仪(Thermo fisher scientific)；T100梯度PCR仪器(Bio-rad)；HH-4恒温水浴锅(常州容冠实验分析仪器厂)；人表皮角质形成细胞(NHEK-C1809，上海冠导生物工程有限公司)；ABTS自由基清除能力检测法使用试剂、MTT比色法使用试剂、乙醇、二甲基亚砜(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；Trizol(北京普利莱基因技术有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 金钗石斛提取液的制备

金钗石斛用25倍量的蒸馏水进行热回流提取2次，温度70℃，提取时间150 min，合并2次提取液，60℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥得到干粉为金钗石斛水提物。

1.2.2 保湿性能测试

选取12名的志愿者，分别以5%金钗石斛提取液(S1)、10%金钗石斛提取液(S2)、对照组为去离子水(CK)进行测试，取测试样品5mL均匀涂抹于志愿者左右前臂屈侧，在使用0、 1 、2、4 h后，分别使用水分含量测试仪对测试区域进行皮肤水分含量精密测试，皮肤水分含量值越大，说明皮肤含水量越高。与CK组进行对照分析，评价S1和S2的保湿效果。

测试结果中涉及的名词定义及相关计算公式如下：

初始值：指未使用任何产品时的基础值。

1.2.3 水通道蛋白3(AQP3)测试

(1)基于角质形成细胞的MTT检测

金钗石斛提取液设置8个浓度梯度，每个浓度梯度设置8个重复，试验设置溶剂对照孔和调零孔，采用MTT细胞活性检测方法，筛选样品在角质形成细胞中的最大安全剂量。

细胞接种：取对数生长期人表皮角质形成细胞消化后接种至96孔板。

样品配制：精密称取石斛水提物适量，分别配制成浓度为2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6 mL/kg的样品。

给药：待细胞铺板率达到40%时，开始给予样品。

培养：给药完成后，将培养板放置在37℃、5%的CO2培养箱中培养。

检测：细胞孵育培养24 h后，弃掉上清，加入事先配好的MTT，37℃避光孵育。4 h后弃掉上清，每孔加150 μL二甲基亚砜，酶标仪490 nm读取OD值。

细胞活性的计算方法见公式(1-1)：

(1-1)

(2)基于角质形成细胞的免疫荧光检测

接种：以3×104个/孔的对数生长期人表皮角质形成细胞接种密度接种至含有盖玻片的24孔板中，37℃，5% CO2培养箱孵育过夜。

配液：精密称取石斛水提物适量配制成浓度500 mL/kg的样品(根据MTT检测试验所得)。

给药：待24孔板中细胞铺板率达到30%时，开始给予样品。

收样：孵育培养结束后，弃掉培养液PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温固定30 min，4℃冰箱保存。

免疫荧光检测：对细胞进行通透、封闭等操作后，AQP3抗体按照1∶500的工作浓度进行孵育，进行免疫荧光染色。

拍照：激光共聚焦显微镜40倍镜下拍照。

1.2.4 丝聚蛋白(FLG)及紧密连接蛋白(CLDN-

1 mRNA)表达检测

(1)基于角质形成细胞的MTT检测

参考1.2.3(1)MTT检测方法

(2)基于角质形成细胞的荧光定量PCR检测

接种：以1.8×105个/孔的人表皮角质形成细胞接种密度接种6孔板中，37℃，5%CO2培养箱孵育过夜。

配液：精密称取石斛水提物适量配制成浓度500 mL/kg(根据MTT检测试验所得)。

给药：待6孔板中细胞铺板率达到40%时，开始给予样品。

培养：给药完成后，将培养板放置在37℃、5%的CO2培养箱中培养。

收样：孵育培养结束后，弃掉培养液每孔加入1 mL Trizol，吹打裂解细胞后，收样。

PCR 检测：采用异硫氰酸胍裂解法，利用RNA提取试剂盒(T2654，北京华越洋生物科技有限公司)经裂解、离心、上清吸附、孵育、洗脱、回收后提取获得RNA，使用反转录试剂盒(WD3126，北京华越洋生物科技有限公司)配置反应体系，经涡旋离心后在42℃孵育40 min，85℃孵育5 min，短暂离心后获得cDNA，进行荧光定量PCR检测。

1.2.5 皮肤表面活性分析方法

试验分为两组，试验组添加S1；对照组为去CK。取测试样品5 mL均匀涂抹于志愿者左右前臂屈侧，等待4 h后使用皮肤测试仪测试受试者使用试验组与对照组后肌肤鳞屑(角质脱落)情况。

1.2.6 抗氧化能力检测

本试验采用ABTS法测定金钗石斛提取液总抗氧化能力，其原理是：ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS·+，在抗氧化物存在时ABTS·+的产生会被抑制，在732 nm或405 nm测定ABTS的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。

(1)准备评价金钗石斛提取液试样0.01 mL，在室温下孵育10 min。接着添加ABTS的50%乙醇溶液(0.1 mM)1 mL，在室温下孵育20 min后，利用分光光度计测定732 nm下的吸光度A；

(2)准 备50%乙醇(体积分数，下同)0.01 mL，在室温下孵育10 min。接着添加ABTS的50%乙醇溶液(0.1 mM)1 mL，在室温下孵育20 min后，利用分光光度计测定732 nm下的吸光度B；

(3)准备评价金钗石斛提取液试样0.01 mL，在室温下孵育10 min。接着添加50%乙醇1 mL，在室温下孵育20 min后，利用分光光度计测定732 nm 下的吸光度C。ABTS自由基清除率计算公式见式(2-2)

(2-2)

式(2-2)中：

A为试样溶液与ABTS溶液混合后OD值；

B为50%乙醇与ABTS溶液混合后OD值；

C为50%乙醇与试样溶液混合后OD值。

2 结果

2.1 金钗石斛植物提取液的保湿性能和效果

由表1可见，与使用前相比，S1在使用1 h后和 2 h后皮肤水分含量均显著性增加，S2在使用 1 h后皮肤水分含量显著性增加，CK组在使用后各时间点皮肤水分含量均无显著性变化。

与CK组相比，S1和S2在使用 1 、2 、4 h后，皮肤水分含量的上升率均大于CK组，且在各时间点均与CK组间在统计学上有显著性差异。

S1与S2相比，在使用后各时间点，两组间在统计学上均无显著性差异。

表1 皮肤水分含量检测结果

2.2 金钗石斛植物提取液对角质形成AQP3表达效果的影响

试验采用荧光显微镜拍照，其中绿色荧光部分显示的是AQP3蛋白表达情况。试验结果表明(图2)，使用金钗石斛提取液后荧光强度明显增高，说明金钗石斛提取液可以有效的提高角质形成细胞水通道蛋白 AQP3的表达。

图1 金钗石斛提取液对角质形成细胞中水通道蛋白AQP3的表达的影响Fig.1 The effect of D. mobile extraction on the expression of aquaporin AQP3 in keratinocytes

2.3 金钗石斛植物提取液对FLG及CLDN-1 mRNA表达效果的影响

构建以上角质形成细胞模型，采用qRT-PCR方法分析金钗石斛提取液对角质形成细胞丝聚蛋白FLG及紧密连接蛋白CLDN-1 mRNA表达的影响。结果表明(图2、图3)，0.25 mL/L处理组较空白对照组无明显差异，0.5 mL/L处理组的mRNA扩增倍数远高于空白对照组，故高浓度金钗石斛提取液可有效提高角质形成细胞丝聚蛋白FLG及紧密连接蛋白LDN-1 mRNA的表达。

图2 金钗石斛提取液对角质形成FLG mRNA的表达的影响Fig.2 Effects of liquid addition on mRNA expression of filaggrin FLG in keratinocytes

图3 金钗石斛提取液对角质形成细胞紧密连接蛋白CLDN-1 mRNA的表达的影响Fig.3 Effects of liquid enrichment element on the expression of CLDN-1 mRNA in keratinocytes

2.4 金钗石斛植物提取液对皮肤表面活性的影响

使用皮肤测试仪评估受试者使用金钗石斛提取液前后肌肤鳞屑的改善情况，图像中白色代表剥落的角质。结果表明(图4)，试验组测试区域涂抹含S1 4 h后，肌肤的鳞屑状态相对于涂抹前有显著改善(图4A、图4B)；而空白组测试区域在涂抹CK 4 h后，肌肤因水分蒸发起屑状态相对于涂抹前更加严重(图4C、图4D)。说明金钗石斛提取液可即时抚平肌肤因干燥引起的鳞屑，润泽肌肤。

图4 金钗石斛提取液抚平肌肤因干燥引起的鳞屑的效果Fig. 4 The effect of D. mobile extraction on smoothing the scale of skin caused by dryness

2.5 金钗石斛植物提取液的抗氧化活性能力

由图5可知，金钗石斛提取液具有一定的清除ABTS自由基活性，在一定的浓度范围内，随着受试浓度的增加，对ABTS自由基的清除率越大。结果说明金钗石斛提取液在生化水平具有一定的抗氧化活性。

图5 金钗石斛提取液对ABTS自由基清除率Fig.5 Scavenging rate of ABTS free radical by D. mobile extraction

3 讨论

生物细胞在其代谢过程中可连续不断地产生大量自由基。在正常情况下，机体会不断产生多种内源性抗自由基的活性物质，但在光辐射或其他内外环境异常情况下，体内抗自由基系统平衡破坏，引起生物膜的脂质过氧化，破坏生物膜的功能和结构完整性，最终会导致皮肤的损伤和衰老[18]。而研究表明石斛有效成分包括生物碱、多糖、微量元素和氨基酸等成分[14]，作用于肌肤可发挥良好的保湿功效。有研究表明[15]，金钗石斛复方提取液可以促进角质细胞水通道蛋白AQP3、紧密连接蛋白ZO-1及Claudin-1的表达，增强细胞的渗透能力，具有良好的锁水、保湿作用，这与本研究发现的金钗石斛可以促进角质细胞水通道蛋白AQP3的表达结果一致。翟东辉等[17]研究表明，石斛多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的活性，起到保护生物膜和延缓衰老的作用。本试验补充了金钗石斛提取液对ABTS自由基清除的能力，这与黄小燕等[19]发现的金钗石斛提取物具有良好的抗氧化能力的结果相符。此外，本试验也证明了金钗石斛还可以提高丝聚蛋白FLG及紧密连接蛋白CLDN-1 mRNA表达效果，足以说明金钗石斛可以充分利用于化妆品的开发和研究。

金钗石斛的现代研究已有几十年历史，在化妆品领域中应用也日益增多。近些年来，国内外一些著名化妆品公司已推出一系列含有金钗石斛提取液的护肤品。研究表明金钗石斛作用于皮肤，确有保湿、美白、延缓衰老等作用，但至今还未发现具有这些作用的化学成分，其保湿、免疫抑制、钙通道抑制、抗氧化和延缓衰老、抗炎美白等作用在化妆品中的应用研究仍有很大发展空间。相信随着分离技术的提高和研究内容的深入，金钗石斛及其复方作为天然植物活性添加剂在化妆品中应用将越来越广。