基于网络药理学研究西红花抗炎作用的分子机制

刘克杰，谢国勇，金书屹，秦民坚

(中国药科大学 中药资源系，江苏 南京 211198)

西红花(CrocussativusL.)为鸢尾科番红花属植物，其原产于伊朗，地中海一带，后经西藏传入中国，故又称番红花或藏红花[1-2]。药用部位为干燥的柱头，因其用途广泛，且产量极低，导致西红花的价格一直居高不下[3]。西红花中主要的活性成分有西红花苷、西红花酸和西红花苦素等，具有镇静安神、凉血解毒、抗炎和提高免疫力的功效[4-5]。网络药理学概念最早由安德鲁·霍普金斯2007年在Nature Biotechnology上提出，它在基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络的基础上, 通过分析基因网络库、蛋白网络库、疾病网络库、药物网络库等现有数据库的信息资料，从系统网络角度揭示生物系统、药物成分和疾病之间的复杂关系。网络药理学强调系统性、动态性、多靶点的特征,而中药方剂中也有“七情配伍”、“君臣佐使”等原则,两者研究的思路和方式深度契合。利用网络药理学工具研究和开发中医药，传承与创新结合，有着重要的意义和广阔的空间[6-8]。

图1 基于网络药理学研究西红花抗炎作用流程图Fig.1 The flow chart of anti-inflammatory effect of Crocus sativus L. based on network pharmacology

1 试验和方法

1.1 西红花化学成分的收集和处理

通过实验室前期已经确定的化学成分同时结合已有的西红花文献数据，整理得到西红花化学数据库。利用TCMSP(http://tcmspw.com/)数据库，以 Lipinsk类药性原则和口服吸收利用度(OB≥30%)为标准对西红花化学数据库中成分进行筛选，利用Chemdraw17.1软件绘制得到的有效成分的化学分子式，文件保存为SDF格式[9]。

1.2 西红花有效成分-靶点网络的构建

将筛选得到的化学成分上传至Swiss(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库[10]，得到有效成分对应的靶点信息，以Probability值进行降序排列，取前20个靶点作为该化合物对应的靶点，利用Cytoscape3.4.1构建西红花有效成分-靶点网络。

1.3 收集相关抗炎靶点信息并构建抗炎靶点-疾病网络

在Therapeutic Target Database(TTD, https://db.idrblab.org/ttd/)，Comparative Toxicogenomics Databas(CTD, http://ctdbase.org/)和OMIM(OMIM, https://omim.org/)中以“ant-inflammatory”为关键词检索得到相关抗炎靶点和对应的疾病信息，构建疾病-抗炎靶点网络[11-13]。进一步将得到的靶点导入String(https://string-db.org/)数据库中，得到蛋白质互相作用网络(PPI)。

1.4 相关靶标匹配以及成分-靶点-疾病网络的构建

将筛选得到的有效成分对应靶点与疾病对应的靶点进行匹配，利用Cytoscape3.4.1软件中Merge功能将有效成分-靶点网络和疾病-抗炎靶点网络合并，合并后得到西红花有效成分-抗炎靶点-疾病网络。

1.5 GO富集分析与KEGG pathway分析

利用DAVID Bioinformatics Resources(DAVID, https://david.ncifcrf.gov/) 对成分-靶点-疾病网络中的靶点进行基因生物功能学(GO)富集分析和KEGG pathway富集分析。

2 结果

2.1 西红花化学成分筛选结果

结合Lipinsk类药性原则和口服吸收利用度(OB≥30%)对西红花化学数据库中成分进行筛选，一共得到21个化学成分，结果见表1。21个化学成分均满足分子量<500，氢键给体数目≤5，氢键受体数目<10，脂水分配系数<5，可旋转键的数量≤10和口服利用度≥30%的要求。

表1 收集得到的21个可用化学成分

2.2 有效成分-靶点网络的构建结果

利用Cytoscape3.7.1软件构建得到西红花有效成分-靶点网络，结果见图2。网络中共包含节点205个(其中化合物节点21个，靶标节点184个)，作用关系574条。红色菱形代表西红花中有效成分，黄色圆形为度值<4的靶点，绿色圆形为度值≥4的靶点。其中度值较高的化合物有西红花酸、山奈酚、咖啡酸、异鼠李素等；度值较高的靶点有人表皮生长因子受体(EGFR)、人血管内皮生长因子受体2(KDR)、肝细胞生长因子受体(MET)、丝裂原活化蛋白激酶12(MAPK12)、单胺氧化酶A(MAO A)、等。试验统计了度值≥4的靶点信息，结果见表2。其中，与信号传导有关的靶点有EGFR、KDR、MAPK12、MET、FGFR1、SELE、MIF、ERBB2、FLT4、，与代谢过程相关的靶点有MAO A、MAO B、COX-2、FASN。

2.3 构建得到的抗炎相关靶点网络

将TTD、CTD和OMIM数据库中筛选得到的抗炎靶点导入Cytoscape3.4.1，得到抗炎-靶点网络，结果见图3a。利用String11.0在线数据库构建得到这些靶点的蛋白质互相作用关系(PPI)网络，结果见图3b。图3a中共有63个与抗炎作用相关的靶点信息，图3b为这63个靶点之间的相互作用，其中degree值较大的靶点有肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶12(MAPK12)和人血管内皮生长因子受体2(KDR)。

图2 西红花有效成分-靶点网络Fig. 2 Effective component - target network in safflower

表2 有效成分对应的靶点信息

2.4 西红花化学成分-靶点-疾病网络

将化学成分-靶点网络和抗炎-靶点网络合并得到西红花化学成分-靶点-疾病网络，见图4。其中西红花抗炎活性成分14个，主要有西红花酸、异鼠李素、山奈酚、咖啡酸、苦藏红花苷酸、藏花醛等；与西红花发挥抗炎作用的靶点有13个，分别是EGFR、KDR、PTPRC、MAPK12、APP、MET、FGFR1、LPAR1、SELE、CD38、MIF、ERBB2、DRD2、FLT4。其中，西红花酸、异鼠李素、山奈酚主要作用于EGFR和MAPK12; 咖啡酸、苦藏红花苷酸、藏花醛、3,5-二甲基苯甲醛主要作用于KDR、MET和FGFR1。从图4可以看出，西红花酸、异鼠李素、咖啡酸是西红花发挥抗炎作用的主要活性成分，EGFR、KDR、MAPK12、PTGRC、ERBB2为西红花发挥抗炎活性的主要靶点。

图3a 抗炎相关靶点网络Fig.3a Ant-inflammation - associated target network

图3b 抗炎靶点相互作用网络(PPI)Fig.3b Ant-inflammatory target interaction network (PPI)

图4 西红花化学成分-抗炎靶点-疾病网络Fig. 4 Chemical composition - anti-inflammatory target - disease network in safflower

2.5 GO分析结果和KEGG pathway分析结果

利用David数据库对预测得到的抗炎靶点进行GO生物功能学分析和KEGG pathway富集分析，分析结果见图5a和图5b。GO分析结果发现，这些靶点主要分布于内膜系统中，分子功能主要集中于蛋白结合、生物催化等功能上。通过参与生物体内细胞信号的传导，细胞代谢和基因表达等过程，从而发挥出抗炎的作用[14]。KEGG pathway富集结果显示，预测的靶点主要分布在信号传导通路以及和癌症相关的通路上。与信号传导有关的通路有Rap1信号通路(Rap1 signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、RAS信号通路(Ras signaling pathway)钙信号通路(Calcium signaling pathway)等，与癌症相关的通路有乳腺癌(Breast cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)、胃癌(Gastric cancer)等。

3 讨论

本研究构建了西红花有效成分-靶点-疾病的网络，通过网络分析得到了西红花发挥抗炎作用的活性成分和靶点。其中与西红花抗炎作用关系密切的化学成分有西红花酸、异鼠李素、咖啡酸，与抗炎作用关系密切的靶点有EGFR、KDR、MAPK12、PTGRC、ERBB2，推测西红花酸、异鼠李素、咖啡酸通过作用于这些靶点，参与了生物体内MAPK signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、IL-17 signaling pathway等信号传导过程，调节了血管通透性，影响了炎症因子的释放和表达，最终发挥了抗炎作用。

图5a 预测靶点的GO富集结果Fig. 5a Predicted target GO enrichment results

图5b 预测靶点的KEGG pathway富集结果Fig. 5b KEGG pathway enrichment results of predicted targets

表皮生长因子受体(EGFR)能与受体酪氨酸激酶(RTK)结合,当EGFR表达增强时，会促使上皮细胞生长因子与RTK形成复合物，影响上皮细胞增殖和分化，进而引起炎症发生[15]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)能被多种炎症因子激活，增加组织细胞炎症发生机率，在炎症发生和发展过程中起着重要的调控作用[16]。推测西红花酸、异鼠李素和咖啡酸通过作用于EGFR、MAPK等靶点，减少了炎症因子的产生和释放，抑制了炎症反应中关键蛋白的表达过程，从而发挥了抗炎作用[16]。动物试验也表明，西红花酸和异鼠李素可以有效抑制LPS诱导大鼠肿瘤坏死因子、IL-6、NO的释放和NF-κB激活，具有显著的抗炎和抗肿瘤作用[17]。这与本研究预测的结果基本一致，表明西红花中抗炎成分通过相关靶点影响了生物的代谢信号传导和相关酶的表达，从而发挥了抗炎和抗肿瘤作用[18]。