酶法提取燕碎中唾液酸工艺优化及其浓缩液制备

简叶叶 李庆旺 庄培荣

摘 要：本文通过单因素实验和正交实验对燕碎中唾液酸酶法提取工艺进行优化。实验得到酶法提取唾液酸的最优工艺参数为：酶解时间2.5 h，液料比35∶1（mL∶g），温度45 ℃，pH为7.5，并以此为条件制备出燕窝浓缩液。

关键词：燕碎;唾液酸;酶法

Abstract：In this paper， single factor experiment and orthogonal experiment were used to optimize the extraction process of sialidase in fragmentary cubilose. The optimum technological parameters of extracting sialic acid by enzymatic method were obtained： enzymatic hydrolysis time 2.5 h， liquid-to-material ratio 35∶1 （ml∶g）， temperature 45 ℃， pH 7.5， and then the birds nest concentrate was prepared.

Key words：Fragmentary cubilose; Sialic acid; Enzymatic method

为研究如何较好地提取保留燕碎中的有效功能成分唾液酸，本文采用木瓜蛋白酶酶法提取燕碎中的唾液酸。单因素实验研究了加酶量、液料比、温度、酶解时间和pH等因素对燕碎中唾液酸提取率的影响，以此为基础，进行正交实验优化，确定酶法提取燕碎中唾液酸的最佳工艺条件，进而制备出燕窝浓缩液，为燕碎的应用开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

燕碎（原产马来西亚）;唾液酸标准品（Sigma公司）;木瓜蛋白酶（酶活力为2.5×106 u·g-1;硫酸铵、95%乙醇、NaOH、茚三酮、冰醋酸。

1.2 仪器

紫外可见分光光度计（型号：WFZUV-2000，尤尼科上海仪器有限公司）;水浴恒温振荡器（型号：THZ-82，常州国华电器有限公司）;台式高速冷冻离心机（型号：HI850R，湖南湘仪实验仪器开发有限公司）;数显恒温水浴锅（型号：HWS，上海晶坛仪器制造有限公司）

1.3 实验方法

1.3.1 酶法提取工艺

准确称取一定质量的燕碎，按一定比例加入蒸馏水，调节pH，添加适量木瓜蛋白酶，放入恒温水浴锅中，酶解一定时间后，沸水浴灭酶10 min[1]。用比色法测定酶解液的吸光值，计算唾液酸提取率。

1.3.2 燕窝中唾液酸提取率的测定方法

测定方法参照陈昕露[1]第四章唾液酸提取率的具体步驟进行测定。

1.3.3 单因素实验

为研究加酶量、液料比、温度、酶解时间和pH等因素[1-2]对燕窝酶解液中唾液酸提取率的影响，分别开展单因素实验，因素水平表见表1。

1.3.4 正交实验

根据单因素实验结果，选取4个对唾液酸提取率影响较大的因素进行正交实验，分析各因素对唾液酸提取率的综合影响，以确定木瓜蛋白酶酶法提取燕窝唾液酸最佳工艺参数。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 液料比对燕碎中唾液酸提取率的影响

在加酶量2%，温度50 ℃，酶解时间2 h，pH 7的条件下，选取液料比（mL：g）分别为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1，对唾液酸的提取率进行实验。由图1知，燕碎的唾液酸提取率在30∶1（mL∶g）时达到最大值，提取率随液料比增加而增大，但当液料比超过30∶1（mL：g）时，提取率反而有所下降。所以选取最佳液料比为30∶1（mL∶g）。

2.1.2 加酶量对燕碎中唾液酸提取率的影响

在液料比30∶1（mL∶g），温度为50 ℃，酶解时间为2 h，pH 7的条件下，选取加酶量分别为2.5%、3.0%、3.5%、4.0%和4.5%，对唾液酸的提取率进行实验。由图2可知，当加酶量介于2.5%～4%，燕碎中的唾液酸提取率随加酶量增加而升高。随着加酶量的增加，酶对底物的作用增强，唾液酸不断酶解溶出，提高了唾液酸提取率。当加酶量大于4.0%，提取率不再增加。因此，加酶量4%是较经济的选择。

2.1.3 温度对燕碎中唾液酸提取率的影响

在液料比30∶1（mL∶g），加酶量4%，酶解时间2 h，pH 7的条件下，选取温度分别为30、40、50、60 ℃和70 ℃，对唾液酸的提取率进行实验。由图3知，酶解温度对唾液酸的提取率影响很大。在30～50 ℃时，唾液酸提取率随温度上升而升高，在50 ℃达到最大值。在50～70 ℃，唾液酸的提取率随温度的升高呈下降趋势。原因可能是实验温度过高，木瓜蛋白酶失去活性降低了酶解过程，唾液酸无法溶出，导致唾液酸提取率逐渐降低。所以最好控制酶解温度在50 ℃左右。

2.1.4 酶解时间对燕碎中唾液酸提取率的影响

在液料比30∶1（mL∶g），加酶量4%，温度为50 ℃，pH 7的条件下，选取酶解时间分别为0.5、1.0、2.0、3.0 h和4.0 h，对唾液酸的提取率进行实验，。由图4知，在0.5～2 h内，唾液酸的提取率急速上升，酶解时间为2 h时提取率最大，之后趋于平缓。原因可能是刚开始随着酶解时间的增加，底物慢慢酶解，故唾液酸提取率也升高，酶解时间为2 h时，燕碎中唾液酸充分酶解溶出达最大值。而后随着酶解时间继续延长，唾液酸不再溶出，提取率不变。所以，最佳酶解时间为2 h。

2.1.5 pH对燕窝中唾液酸提取率的影响

在液料比30∶1（mL∶g），加酶量4%，温度为2 h，酶解温度为50 ℃的条件下，选取pH分别为6、7、8、9、10，对唾液酸的提取率进行实验。由图5知，在pH在7以下，随着pH升高，唾液酸提取率逐渐升高，pH在7时达到最高点;当pH介于7～10，唾液酸提取率逐渐降低。因此，确定木瓜蛋白酶在酶法提取唾液酸中的最适pH为7。

2.2 正交实验结果分析

根据2.1实验结果，选取液料比、温度、酶解时间和pH进行四因素三水平正交实验，按L9（34）正交设计表，正交因素水平见表2，正交实验结果及数据分析见表3。固定条件为：加酶量4%。由表3知，4个因素对燕碎唾液酸木瓜蛋白酶酶解提取的影响大小为：C>A>B>D，即酶解时间>液料比>温度>pH。由k值得最优组合为A3B1C3D3，即：酶解时间2.5 h，液料比35∶1，温度45 ℃，pH为7.5，得到唾液酸提取率为（9.48±0.04）%，高于正交实验表中的任何一组。

2.3 燕窝浓缩液制备

以上述2.2的实验结果为依据，在液料比35∶1，酶解时间2.5 h，酶解温度45 ℃，pH为7.5制备燕碎的酶解液。利用真空浓缩法[3]，控制浓缩温度（30～60 ℃），时间（45～150 min）和压力（1～12 kPa），对燕窝酶解液进行真空浓缩。经此步骤后的燕窝浓缩液，与原本的燕窝酶解液相比约有90%水分被移除，而燕窝的营养成分仍得以保留。

3 结论

对燕碎中唾液酸酶法提取工艺进行单因素实验，得到最佳液料比30∶1（mL∶g）、酶解温度50 ℃、酶解时间2 h和pH 7，加酶量4%为宜。并在单因素实验基础上进行正交实验。实验发现酶法提取唾液酸的最优工艺参数为酶解时间2.5 h，液料比35∶1（mL∶g），温度45 ℃，pH为7.5，得到的唾液酸提取率为（9.48±0.04）%。并以此条件制备出了一款营养价值高保留的燕窝浓缩液。

参考文献：

[1]陈昕露.不同加工条件对燕窝唾液酸提取效果的影響及燕窝功能特性的研究[D].福州：福建农林大学，2013.

[2]王 焕，秦英杰，刘立强，等.多效膜蒸馏技术用于果汁浓缩[J].化学工业与工程，2012，29（4）：50-57.

[3]陈 婕.橄榄浓缩汁加工技术的研究[D].福州：福建农林大学，2012.