芎麻汤提取物对肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型大鼠脑组织中5-HT、CGRP的影响

刘顶鼎 杨菁 刘冬 郭建生 毛效贤 曾贵荣 周英

摘 要 目的：研究芎麻湯提取物对肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型大鼠脑组织中5-羟色胺（5-HT）、降钙素基因相关肽（CGRP） 的影响。方法：将50只雄性自发性高血压（SHR）大鼠按血压随机分为模型对照组、正天丸阳性对照组（1.6 g/kg）和芎麻汤提取物低、中、高剂量组（4.5、9.0、18.0 g/kg，以生药量计），每组10只;并另取10只正常大鼠作为正常对照组。给药组大鼠分别灌胃相应药物，每天1次，连续28 d;正常对照组和模型对照组大鼠灌胃等体积生理盐水。末次给药后，除正常对照组外，其余各组大鼠均采用电刺激三叉神经节（10 min）法复制肝阳上亢兼瘀血型偏头痛大鼠模型，并于造模后再维持给药1次。30 min后，观察大鼠一般行为学及舌质情况，测定大鼠血压，采用酶联免疫吸附法测定大鼠脑组织中5-HT、CGRP含量，并采用Western blot法测定大鼠脑组织中CGRP蛋白表达水平。结果：与正常对照组比较，模型对照组大鼠出现眼结膜颜色加深变红、过度理毛、甩头等行为学变化，大部分大鼠舌质紫暗，并且其收缩压和脑组织中CGRP含量及蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01），脑组织中5-HT含量显著降低（P<0.01）。与模型对照组比较，各给药组大鼠的上述行为学变化及舌质变化均明显改善;正天丸阳性对照组和芎麻汤提取物高剂量组大鼠收缩压、脑组织中CGRP含量及蛋白表达水平显著降低（P<0.05）;正天丸阳性对照组和芎麻汤提取物中、高剂量组大鼠脑组织中5-HT含量显著升高（P<0.05）。结论：芎麻汤提取物对肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型大鼠有明显的保护作用，其机制可能与降低脑组织中CGRP含量、升高脑组织中5-HT含量有关。

关键词 芎麻汤提取物;肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型;自发性高血压大鼠;5-羟色胺;降钙素基因相关肽

中图分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）01-0024-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.01.05

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the effects of the extract of Xiongmatang on 5-HT and CGRP in brain tissue of rats with liver-yang hyperactivity and blood stagnation migraine. METHODS： Fifty male spontaneously hypertension （SHR） rats were randomly divided into model control group， Zhengtian pill positive control group （1.6 g/kg）， the extract of Xiongmatang low-dose， medium-dose and high-dose groups （4.5， 9.0， 18.0 g/kg， by crude drug）， with 10 rats in each group. Another 10 normal rats were taken as normal control group. Administration group was given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 28 d. Normal control group and model control group were given equal volume normal saline intragastrically. After last administration， except for normal control group， other groups were used to stimulate trigeminal ganglia （10 min） to establish liver-yang hyperactivity and blood stagnation migraine model， and maintained the administration once more after making the model. 30 min later， general behavior and tongue quality of rats were observed， and the blood pressure was measured; the contents of 5-HT and CGRP in cerebral tissue of rats were determined by ELISA. The protein expression of CGRP in cerebral tissue of rats were determined by Western blot method. RESULTS： Compared with the normal control group， the rats in the model control group had behavioral symptoms， such as the color of conjunctiva deepened and reddened， excessive hairdressing， head flicking， and most of the rats had purple tongue; the systolic pressure and the content and protein expression of CGRP were all increased obviously （P<0.05 or P<0.01）， while the content of 5-HT in cerebral tissue was decreased obviously （P<0.01）. Compared with model control group， general behavior and tongue quality of rats were improved significantly in administration groups. Systolic pressure， the content and the protein expression of CGRP in cerebral tissue of rats were decreased significantly in Zhengtian pill positive control group and the extract of Xiongmatang high-dose group （P<0.05）， while the content of 5-HT  in cerebral tissue of rats were increased significantly in Zhengtian pill positive control group， the extract of Xiongmatang medium-dose and high-dose groups （P<0.05）. CONCLUSIONS： The extract of Xiongmatang has obvious protective effect on liver-yang hyperactivity and blood stagnation migraine model rats， the mechanism of which may be associated with reducing the content of  CGRP in cerebral tissue and raising the content of 5-HT in cerebral tissue.

KEYWORDS   Extract of Xiongmatang; Liver-yang hyperactivity and blood stagnation migraine model; Spontaneously hypertension rats; 5-HT; CGRP

偏头痛是一种临床常见的神经性疾病，其特征是由神经血管功能障碍引起的周期性头痛。2017年《Lancet》杂志发表的世界卫生组织（WHO）2015年全球疾病负担调查的研究结果表明，偏头痛为人类第六位常见疾病，按失能所致生命损失（Years of life lost to disability，YLDs）计算，偏头痛为第二位致残性疾病[1]。偏头痛病因复杂，发病机制尚无明确定论。由Moskowitz M提出的三叉神经血管反射学说是目前的主流学说，其认为神经源性炎症反应是偏头痛发病机制的基础，5-羟色胺（5-HT）、一氧化氮（NO）、内皮素1（ET-1）等血管活性物质含量的异常变化及降钙素基因相关肽（CGRP）、P物质（SP）等神经递质的异常分泌，在神经源性炎症反应的发生发展中起着重要的作用[2]。目前，基于三叉神经血管反射学说的模型一般认为有三叉神经节刺激模型、硬脑膜神经源性炎症模型、硝酸甘油动物模型等[3]。

偏头痛属中医“头风”范畴，《中药新药临床指导原则（试行）》中根据中医证候诊断标准，将偏头痛分为肝阳上亢头痛证、瘀血头痛证、痰浊头痛证、肾虚头痛证、气血亏虚头痛证五个证候[4]。经长期临床观察，单一病机导致头痛的很少，常有2～3个病机的夹杂因素，在诸多因素中瘀血阻络、肝阳上亢为偏头痛发病的关键环节[5-7]。中医辨证论治也多以活血、平肝、祛风三法为本病主要治疗方法[5-9]。偏头痛瘀血挟肝阳上亢证，症见头痛日久如刺或胀，痛有定处，或心烦易怒，目赤，口苦;或面红，口干，舌质紫暗，或有瘀斑、瘀点等[4]。但目前的实验研究中，暂无相对应的肝阳上亢兼偏头痛瘀血动物模型研究。

芎麻汤源于《圣济总录》之大芎丸，《本草纲目》称其为天麻丸，《医宗金鉴》将丸剂改成汤剂，定名“芎麻汤”。芎麻汤由天麻、川芎组成，具有平肝、活血、通络止痛之功，主治偏头痛、头风眩晕、身体拘倦，在临床上尤擅于治疗肝阳上亢兼瘀血型偏头痛[9-10]。本课题组前期研究发现，芎麻汤对硝酸甘油偏头痛模型大鼠的改善作用明显，能有效减轻模型大鼠行为学症状，其作用机制与调节偏头痛模型大鼠血浆中5-HT、CGRP含量和降低三叉神经颈髓复合体（TCC）中5-HT、CGRP表达等有关[11-16]。高血压属于中医“风眩”范围，龚一萍[17]研究发现，平肝潜阳、清热活血药物对高血压具有较好的降压作用，并认为肝阳上亢与高血压病关系密切。《血证论》说：“世谓血块为瘀，清血非瘀;黑色为瘀，鲜血非瘀;此论不确。盖血初离经，清血也，鲜血也，然即是离经之血，虽清血鲜血，亦是瘀血”[18]，因此中医认为“离经之血即为瘀”。基于前期研究基础及以上中医理论，本研究拟采用电刺激自发性高血压（SHR）大鼠复制肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型，并以具有疏风活血、养血平肝、通络止痛功效的中成药正天丸为阳性对照，方证对应观察芎麻汤提取物对肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型大鼠脑组织中5-HT、CGRP的影响，探讨其治疗肝阳上亢兼瘀血型偏头痛可能的作用机制。

1 材料

1.1 仪器

TD4低速离心机（南京普朗医用设备有限公司）;MR-96A酶标仪（深圳迈瑞科技有限公司）;LABOSPECT003自动生化分析仪（日本日立公司）;DYY-Ⅲ-40B转移电泳槽（北京六一仪器厂）;WH-985-C8翻转振荡器（太仓市科教器材厂）;TS.B-108往复式脱色摇床（美国Qilinbeier公司）;BP-100A全自动大小鼠无创血压系统（成都泰盟生物科技有限公司）;HHS-2电子恒温不锈钢水浴锅（上海南阳仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

川芎饮片（产地：四川，批号：17031104）和天麻饮片（产地：贵州，批号：17052001）均购自老百姓大药房连锁股份有限公司东塘店，并经湖南中医药大学药学院郭建生教授鉴定分别为伞形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎和兰科植物天麻（Gastrodia elata Blume.）的干燥块茎;正天丸（华润三九医药股份有限公司，批号：160324，规格：6 g）;大鼠5-HT 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒、大鼠CGRP ELISA试剂盒（美国AD公司，批号：160322、170813）;兔抗CGRP抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体（美国KPL公司，批号：170519、170612、170322）;小鼠β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国Proteintech公司，批号：60008-1-Ig）;二喹啉甲酸（BCA）蛋白质浓度测定试剂盒、电化学发光（ECL）显色试剂盒、RIPA裂解液（上海生工生物工程股份有限公司，批号：170818、CS06668- 0050、A610425- 0005）;其他試剂均为分析纯。

1.3 动物

SHR大鼠50只、SD大鼠10只，♂，SPF级，体质量220～250 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002，实验动物使用许可证号：SYXK（湘）2014-0012。大鼠购入后饲养在新药药效与安全性评价湖南省重点实验室中的SPF级动物实验室内，所有动物实验研究均符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。实验期间环境温度为20～26 ℃，相对湿度为40%～70%。

2 方法

2.1 芎麻汤提取物的制备

取川芎200 g、天麻50 g，加水1 000 mL浸泡2 h，煎煮2次，每次煎煮保持微沸30 min，合并滤液，水浴浓缩得到140 g浸膏，得率为56%。

2.2 造模与分组

将50只SHR大鼠按血压随机分为5组，分别为模型对照组、正天丸阳性对照组（1.6 g/kg，根据成人临床剂量换算而得的等效剂量）和芎麻汤提取物低、中、高剂量组（4.5、9.0、18.0 g/kg，以生药量计，分别根据临床用量换算而得的等效剂量的1、2、4倍剂量）;另取10只SD大鼠作为正常对照组。各给药组大鼠分别灌胃相应药物，正常对照组和模型对照组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天给药1次，连续给药4周（28 d）。实验第29天，除正常对照组外，其余各组大鼠均参照Pei P等[19]、朱玉璞等[20]报道的方法造模：以2%戊巴比妥钠（2.0 mL/kg）腹腔注射麻醉后将大鼠固定在大鼠脑立体定位仪上，剃除两眼到两耳之间的毛发，用碘酒消毒，逐层切开皮肤、肌肉，暴露颅骨。在前囟点后3.2 mm，旁开2.8 mm处（右边）用牙科钻插孔，将刺激电极插入三叉神经节，深度为硬脑下9.3～9.5 mm，术后持续麻醉。电极刺激参数为周期200 ms、波宽5 ms、幅度10 V，连续刺激10 min。待大鼠清醒后，各组大鼠再次灌胃对应药物。

模型成功评价标准：以大鼠双眼结膜颜色加深变红，易激惹，频繁打斗，提尾时尖叫、惊跳甚至咬人等行为学变化及血压升高，为肝阳上亢证建立成功的观察标准[17，21];以电刺激大鼠时出现咀嚼肌收缩、口鼻分泌物增多的症状，清醒后大鼠节律性抖动头部、过度理毛、甩头、扭头等行为学表现[19-20]及舌质紫暗，或有瘀斑、瘀点[22]为瘀血型偏头痛建立成功的观察标准。

2.3 一般情况观察

电刺激时，观察大鼠是否出现咀嚼肌收缩、口鼻分泌物增多的症状;电刺激结束待大鼠清醒后及末次给药后30 min，均观察其一般行为学症状及舌质情况，以判定模型是否建立成功。

2.4 血压测定

末次给药后30 min，分别采用尾动脉搏动法测定各组大鼠血压（1 mmHg≈133.322 Pa）。

2.5 脑组织中5-HT、CGRP含量测定

血压测定后，将大鼠处死，解剖取其脑组织，以1 g脑组织加入2 mL生理盐水的比例进行匀浆，然后以     3 000 r/min离心10 min，取上清液，参照ELISA试剂盒说明书操作检测脑组织匀浆中5-HT、CGRP含量。

2.6 脑组织中CGRP蛋白表达测定

采用Western blot 法检测脑组织CGRP蛋白表达。取各组大鼠脑组织50 ?g，9 g/L氯化钠溶液冲洗后加入10 ?L细胞裂解液，冰上裂解1 h，在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，取上清，采用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取组织提取液行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，然后在100 V 、4 ℃转移2 h至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上;以含5%脱脂奶粉、聚山梨酯20的磷酸盐缓冲液（PBS）（PBST缓冲液）室温孵育2 h，加入封闭液稀释的一抗（1 ∶ 200），室温孵育2 h，0.1% Triton-PBS溶液洗膜3次，10 min/次;加入封闭液稀释的二抗（1 ∶ 2 000），室温孵育1 h，0.1% Triton-PBS洗膜3次，10 min/次;参照试剂盒说明书进行ECL检测液显色、X光胶片显影定影，并采用Image J 2x软件检测条带灰度值，CGRP蛋白的相对表达强度=CGRP条带灰度值/内参β-actin条带灰度值。

2.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学分析软件进行数据分析。计量资料采用x±s表示，若资料符合正态分布且方差齐时，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验;若资料呈非正态分布或（和）方差不齐时，先进行变量变换后再采用单因素方差分析和t检验进行比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 芎麻汤提取物对大鼠一般行为学的影响

电刺激时大鼠均出现咀嚼肌收缩、口鼻分泌物增多的症状。大鼠清醒后，与正常对照组比较，模型对照大鼠均出现双眼结膜颜色加深变红，易激惹，频繁打斗，提尾时尖叫、惊跳甚至咬人，节律性抖动头部、过度理毛、甩头、扭头等行为学表现，并且多数大鼠舌质紫暗，少数大鼠有明显瘀斑或瘀点，这提示肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型建立成功。给药后，正天丸阳性对照组和芎麻汤提取物各剂量组大鼠以上症状均明显好转，个别大鼠以上症状甚至完全消失。

3.2 芎麻汤提取物对模型大鼠收缩压的影响

首次给药前：与正常对照组比较，模型对照组大鼠收缩压显著升高（P<0.01）;与模型对照组比较，正天丸阳性对照组和芎麻汤提取物各剂量组均无明显差异（P>0.05）。末次给药后：与正常对照组比较，模型对照组大鼠收缩压显著升高（P<0.05）;与模型对照组比较，各给药组大鼠收缩压均不同程度降低，正天丸陽性对照组和芎麻汤提取物高剂量组大鼠收缩压差异具有统计学意义（P<0.05）。各组大鼠收缩压测定结果见表1。

3.3 芎麻汤提取物对模型大鼠脑组织中5-HT、CGRP含量的影响

与正常对照组比较，模型对照组大鼠脑组织中5-HT含量显著降低（P<0.01），CGRP含量显著升高（P<0.01）。与模型对照组比较，正天丸阳性对照组和芎麻汤提取物中、高剂量组大鼠脑组织中5-HT含量显著升高（P<0.05），正天丸阳性对照组和芎麻汤提取物高剂量组大鼠脑组织中CGRP含量显著降低（P<0.05）。各组大鼠脑组织中5-HT、CGRP含量测定结果见表2。

3.4 芎麻汤提取物对模型大鼠脑组织中CGRP蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型对照组大鼠脑组织中CGRP蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与模型对照组比较，正天丸阳性对照组和芎麻汤提取物中、高剂量组大鼠脑组织中CGRP蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。各组大鼠脑组织中CGRP蛋白表达的电泳图见图1，表达水平测定结果见表3。

4 讨论

芎麻汤由天麻、川芎组成，方中天麻专入肝经，息风平肝，通络止痛，主治头风头痛;川芎为血中气药，主入肝、胆经，行气开郁，活血止痛，主治风冷头痛眩晕等血瘀所致之疾，《日华子本草》载：“治一切风，一切气，一切劳损，一切血，……破癥结宿血，养新血”。两药合用共奏平肝、活血、通络止痛之功，在临床上尤擅肝阳上亢兼瘀血型偏头痛的治疗[9-10]。同时研究发现，与常规西药比较，芎麻汤能更好地缓解偏头痛患者的临床症状，减少头痛发作次数和持续时间[23]。

研究发现，SHR大鼠会出现双眼结膜颜色加深变红，易激惹，频繁打斗，提尾时尖叫、惊跳，甚至咬人等一般行为学变化，以上变化与肝阳上亢证临床表现极为相似[21]。电刺激大鼠三叉神经节建立偏头痛模型时，需要进行开颅手术，手术中会导致出血，中医自古有“离经之血即为瘀”“因瘀血为实邪，不通则痛”的说法，因此，模型大鼠除了会出现节律性抖动头部、过度理毛、甩头、扭头等偏头痛行为学表现外[19-20]，舌质会由淡红色变化为紫暗或有瘀斑、瘀点[22]。基于以上理论研究，本课题组大胆提出采用电刺激SHR大鼠建立肝阳上亢兼瘀血型偏头痛大鼠模型。在预实验中发现，电刺激SHR大鼠（♀♂各半）后，上述行为学症状及舌质变化均与理论情况一致，说明造模成功。在偏头痛的基础研究上，为能得到稳定的结果一般均选择♂啮齿类动物建立偏头痛模型[24]，故本研究正式实验时选择♂大鼠为实验动物。为方证对应验证芎麻汤对肝阳上亢兼瘀血型偏头痛的作用，实验中选用正天丸为阳性对照药。正天丸是由川芎、钩藤等15味中药组成的中药复方制剂，具有养血平肝、疏风活血、通络止痛等功效，适用于治疗中医中瘀血阻络、肝阳上亢等引起的多种头痛和现代医学中偏头痛、神经性头痛等多种类型头痛，是目前临床治疗偏头痛的主要中成药之一[25-26]。

本研究通过探索并成功建立了一种通过电刺激SHR大鼠复制肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型的“病证结合”造模方法。实验结果显示，复制的肝阳上亢兼瘀血型偏头痛大鼠除一般行为学症状及舌质发生了明显变化之外，脑组织中与偏头痛发病机制密切相关的重要生化指标5-HT、CGRP含量变化情况，与李凤金等[27]复制的硝酸甘油型偏头痛模型大鼠5-HT含量显著降低、CGRP含量显著升高的情况也一致，均说明造模成功。同时发现，芎麻汤提取物可改善肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型大鼠行为学症状及舌质情况，可明显降低其收缩压，调节其脑组织5-HT含量的过度降低及CGRP含量的过度升高，下调其脑组织CGRP蛋白表达。方证对应的阳性对照药正天丸也具有同样的作用，与李涛等[28]对正天丸的研究结果一致，这说明芎麻汤提取物與肝阳上亢兼瘀血型偏头痛方证对应。但本实验在研究过程中也存在不足之处：一是实验组别设计时未设置模型空白对照组（仅开颅不电刺激），即假手术组，因此无法排除开颅手术对大鼠的影响;二是针对瘀血证仅用舌质变化进行主观评价，未检测血液流变学参数等客观评价指标，有影响实验结果可靠性的风险。基于本研究结果及经验总结，本课题组将在接下来的研究中进行改进，以更全面客观地研究芎麻汤提取物对肝阳上亢兼瘀血型偏头痛的治疗作用及作用机制。

本实验结果能为肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型的研究及芎麻汤的中医临床应用、分子水平上进一步的机制研究提供一定的实验依据。

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（收稿日期：2019-09-15 修回日期：2019-11-16）

（编辑：林 静）