胆木化学成分对HUVEC细胞活性氧和通透性的影响

麦世瑛 王怡然 李永辉 谭银丰 张旭光 张俊清 李锦云

摘要 目的：研究膽木化学成分对HUVEC细胞通透性、ROS生成水平的影响，探讨胆木对HUVEC的保护作用。方法：设有对照组和观察组，通过FITC标记的右旋糖酐（Dextran）试剂盒检测胆木成分对AngⅡ诱导HUVEC单层通透性的影响;以DCFH-DA试剂盒检测胆木化学成分对ROS的抑制作用，采用LPS诱导HUVEC细胞的ROS。结果：胆木生物碱及酚酸类成分对LPS引起的ROS水平增加有抑制趋势，10 μg/mL的喜果苷促进作用有统计学意义（P<0.05）。胆木成分具有促进HUVEC细胞通透性增加的作用，其中异常春花苷内酰胺、喜果苷和原儿茶酸对HUVEC细胞通透性有明显的促进作用。结论：胆木抗炎作用可能与其促进活性氧生成及通透性增加有关。

关键词 胆木;活性氧;通透性;ROS;乌檀;生物碱;酚酸;增殖

Effects of Chemical Constituents of Nauclea Officinalis on Reactive Oxygen Species and Permeability of HUVEC Cells

MAI  Shiying1，WANG Yiran1，LI Yonghui1，TAN Yinfeng1，ZHANG Xuguang1，ZHANG Junqing1，LI Jinyun2

（1 Hainan Provincial Key Lab of R&D on Tropic Herbs，Hainan Medical University，Haikou 571199，China; 2 Hainan Senqi Pharmaceutical Co.，Ltd，Haikou 570216，China）

Abstract Objective：To observe the effects of chemical components from Nauclea officinalis on the HUVEC monolayer permeability and reactive oxygen species（ROS）production induced by pro-inflammatory factors，and to investigate the protective effect of Nauclea officinalis on HUVEC.Methods：A control group and an experimental group were set up.FITC-Dextran kit was used to detect the effects of components from Nauclea officinalis on AngII-induced HUVEC monolayer permeability; DCFH-DA kit was used to detect the inhabitation effects of components from Nauclea officinalis on ROS.The ROS in HUVEC cells were induced by LPS.Results：The results showed that the composition of Nauclea officinalis inhibited the increase of ROS induced by LPS，but the promotion effect of 10 μg/mL of vincosamide was significant.The composition of Nauclea officinalis had the effects of promoting the increase of HUVEC cell permeability.Among them，strictosamid，vincosamiide and protocatechuic acid had significant promoting effects on HUVEC cell permeability.Conclusion：The anti-inflammatory effects of Nauclea officinalis may be related to the promotion of active oxygen production and increased permeability.

Keywords Nauclea officinalis; Reactive oxygen species; Permeability; ROS; Nauclea; Alkaloids; Phenolic acid; Proliferation

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.01.008

胆木（Nauclea officinalis Pierre ex Pitard.）为茜草科乌檀属植物，又名乌檀、熊胆树、黄胆木、山熊胆等，以枝、皮入药，具有清热解毒、消肿止痛的功效，用于治疗咽喉炎、支气管炎、急性扁桃体炎等，有“植物抗生素”之称，主要用于感冒中上呼吸道感染的预防和治疗[1-2]。机体存在炎性反应时，前期损伤因子直接或间接造成组织和细胞的破坏[3-4];后期通过相关细胞的增殖、迁移与愈合等途径促进炎性反应的修复[5]。高氧化活性的含氧自由基（ROS）作为调节细胞增殖的重要信号因子[6]，有研究表明其产量的适度增加能促进内皮细胞增殖[7]。因此本研究主要观察胆木成分抗炎活性、活性氧水平、通透性之三者间的关系及胆木成分在其中发挥的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人脐静脉内皮细胞（HUVEC细胞）购自上海哥凡生物科技有限公司（货号GF067）。将HUVEC细胞维持在含有10%胎牛血清和10%肝素钠的青霉素/链霉素补充的F-12k中，并在细胞培养箱（37 ℃，95%空气和5%CO2）中培养。每2～3 d更换培养基，并在汇合度达70%～80%时进行传代培养，按1∶2或1∶3传代。

1.1.2 药物及试剂 绿原酸（批号PRF9012741，质量分数99.48%）购买于成都普瑞法科技开发有限公司，原儿茶酸（批号P104382-5 g，质量分数≥97%）购买于炼石商城;喜果苷、短小舌根草苷和异长春花苷内酰胺为本课题组分离得到（质量分数≥95%）。AngⅡ购买于炼石商城（货号A800620-10 mg，纯度：90%），胎牛血清（FBS）购自Gibco（美国，货号16000044），PBS（美国Hyclone，货号SH30256.01），F-12k培养液购自武汉博士德生物工程有限公司（货号PYG0093），肝素钠购自Solarbio（货号H8060-1 g）;细胞生长因子（ECGS）（货号KGY1052）购自南京凯基生物科技发展有限公司，青、链霉素混合液（Biosharp，货号BL505A），胰蛋白酶（含EDTA）（美国Hyclone，货号SH30042.01），CCK-8试剂盒（Biosharp），活性氧试剂盒（南京建成），LPS其他常用生化试剂均为国产分析纯。各测试样品以DMSO溶解并稀释至合适浓度，-20 ℃保存备用。水为去离子超纯水。

1.1.3 仪器 LabTower EDI15超纯水一体机（美国赛默飞世尔科技）;RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;KQ-100V超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）;梅特勒XS105DU电子分析天平（瑞典梅特勒）;Waters e2696/2996高效液相色谱仪;DZF-6053台式真空干燥箱（上海蓝豹）;LC-20A制备液相（日本岛津）;Jasco V-650紫外分光光度计（日本分光）;色谱柱为Waters Symmetry C18（4.6×150 mm，5 μm）;TGL-16G台式高速离心机（上海安亭仪器厂）;CO2恒温培养箱（美国，Thermo公司）;SPECTRA MAX 190酶标仪（中国）;CKX41倒置显微镜（日本奥林巴斯）;蔡司VERT.A1倒置荧光显微镜（中国）。

1.2 方法

1.2.1 胆木成分的制备 胆木茎枝（4.7 kg）粉碎，用水提取（10 L/5 h/次，共3次），浓缩得浸膏118 g。分别用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取浸膏，浓缩后分别为19.6 g和16.7 g。经反复硅胶柱色谱，制备色谱等分离萃取浸膏，共得到5个化合物：喜果苷[8]，异常春花苷内酰胺[9]，短小蛇根草苷[10]，绿原酸[11]，原儿茶酸[12]。

1.2.2 采用CCK-8方法评价胆木化学成分对HUVEC细胞的促进增殖作用 参照文献[13]，采用CCK-8的方法评价胆木化学成分对HUVEC细胞的促进增殖作用。具体方法：细胞以1.5×104个细胞/0.2 mL/孔的密度接种在96孔板中。分别取用不同浓度的样品（浓度设定如图1所示）或DMSO作为对照处理细胞，并在细胞培养箱中孵育。24 h后，弃掉旧培养液，向每个孔中加入100 μL CCK-8稀释液，并将平板再次放回培养箱，分别于1 h、2 h、3 h、4 h使用SPECTRA MAX 190酶标仪（Molecular Devices，China）测量450 nm处样品的吸光度。

1.2.3 以FITC标记的右旋糖酐（Dextran）试剂盒检测胆木成分对AngⅡ诱导HUVEC单层通透性的影响 将HUVEC用0.5%胰蛋白酶消化并制成密度为4×105/mL细胞悬液，各吸250 μL接种于试剂盒的嵌套小室内，将嵌套置于24孔培养板的小井中，小井中加入500 μL培养液，放入37 ℃含5% CO2湿度为95%～100%的孵箱内培养，嵌套和24孔培养板的小井构成2个相对隔离的小室：嵌套小室和外室。嵌套小室和外室可通过生长在嵌套小室的内皮细胞单层进行物质交换。嵌套小室上内皮细胞生长成致密连接状态后，在嵌套小室内室更换新鲜含药物（或样品）的培养基（不含FBS）饥饿培养，模型组、空白组及外室更换成新鲜不含FBS的培养基。24 h后药物组及模型组加入250 μL稀释好（均用含2% FBS的F-12k稀释）的Ang Ⅱ（10-6M），并设正常对照组（只加250 μL含2% FBS的F-12k），加入稀释好的FITC-Dextran作为通透性指示剂。分别于0.5 h、1 h、2 h、4 h后收集外室培养液，荧光酶标仪检测激发波长488 nm，发射波长：530 nm的荧光值，n=3，内皮细胞单层对FITC-Dextran的相对通透率按以下公式计算（以模型组为对照），相对通透率=（药物组-模型组）/（模型组-空白组）×100%。

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（2018-12-27收稿 责任编辑：芮莉莉）

基金项目：海南省自然科学基金项目（20168270）;海南省研究生创新研究项目（Hys2017-182）作者简介：麦世瑛（1994.05—），女，硕士，药师，研究方向：药物活性成分研究，E-mail：854363381@qq.com通信作者：李永辉（1974.09—），男，博士，研究员，研究方向：药物分析与听代谢动力学研究，E-mail：lyhssl@126.com