采用高效液相-串联质谱测定饲料中的氨基酸

程传民,李 云，柏 凡,王宇萍,陈 红,李 茂，张 林

(四川省饲料工作总站，四川 成都 610041)

天然氨基酸分析是饲料分析的重要项目。目前氨基酸分析通常采用以下2种方式：离子交换色谱分离-柱后衍生(氨基酸分析仪)和柱前衍生-反相色谱法分离(高效液相色谱仪)[1-3]。在我国高效液相色谱串联质谱普及率越来越高的情况下，本研究为饲料中氨基酸的检测提供一种新的分析手段，采用微波消解法进行前处理，解决了亮氨酸和异亮氨酸分离度达不到要求等问题，能够满足饲料中涉及的16种氨基酸分析需求[4-6]。

氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。自然界存在300多种氨基酸，但构成天然蛋白质的氨基酸只有20种，这20种氨基酸又称为天然氨基酸。尽管天然氨基酸多达20种，但由于蛋白质水解过程中天冬酰胺和谷氨酰胺分别转化为天冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸则以胱氨酸形式存在，色氨酸在酸水解时完全被破坏，因而对于含蛋白质食品、饲料等样品的氨基酸分析时，只需分析天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)等16种氨基酸[7-10]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1290/6460液质联用仪配有电喷雾源，美国Aglient；0.01 mg电子天平，德国赛多利斯公司;微波消解仪，美国Ethos Touch Control公司；涡旋振荡器，禾本森科有限公司；电动振荡器，美国LKA-werke公司；高速冷冻离心机，Biofug Primo R公司。

氨基酸混合标准品，2.5 mol/L，SIGMA公司；乙腈、甲酸，色谱纯，美国Fisher Scientific公司；甲酸铵，Fisher chemical；盐酸，分析纯，天津科密欧化学试剂公司。

甲酸铵溶液200 mmol/L pH 3.0：称取6.3 g甲酸铵用水定容到500 ml，用甲酸调节pH值到3.0;氨基酸标准工作液100 mmol/L：移取1 ml的氨基酸标准储备液2.5 mol/L于25 ml容量瓶中，用0.06 mol/L盐酸溶液定容;流动相A:10%甲酸铵溶液200 mmol/L pH 3.0水溶液;流动相B:10%甲酸铵溶液200 mmol/L pH 3.0乙腈溶液。

1.2 试验方法

准确称取试样(20～30)mg于微波水解杯中,加6 mol/L盐酸0.5 ml，然后充入氮气5 min，盖好水解罐,将罐放入密封装置中,拧紧密封装置；将密封装置于微波消解炉中，接上温度传感器，在160℃、800 W下,水解8 min；在160℃、600 W下，水解15 min。当温度冷却至室温后打开密封装置，取出水解罐，将水解杯从水解罐中逐一取下，用水转移至50 ml容量瓶中,过0.22 μm滤膜后供液相色谱串联质谱测定。

1.3 色谱条件

Agilent poroshell 120 HILIC-Z色谱柱(2.1×100)mm，2.7 μm,美国安捷伦科技公司；柱温：35℃；进样体积：2 μl；流速：800 μl/min；流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应监测；毛细管电压：正模式：4 000 V；负模式：3 500 V；干燥气温度：350℃;干燥气流量：13 L/min；雾化气压力40 pa；扫描方式、监测离子对(m/z)和其他参考条件参见表2。

2 讨论

2.1 方法条件的优化

2.1.1前处理条件的优化

为了提高试验效率，采用微波消解的方法替代氨基酸的常规水解法，通过多次与常规水解法的比较，在10 min升温到160℃保持20 min条件下，效果可以达到要求。变异系数均小于8.0%，说明本研究测定结果比较稳定，从T统计值看均小于T0.05,4(2.78)说明两方法无显著差异，检测结果见表3。

表2 氨基酸质谱参数

表3 饲料中氨基酸常规水解法与微波水解法比较结果(n=6)

2.1.2色谱柱的选择

由于部分氨基酸的极性较大，在普通的C18反相色谱柱上的保留较差，因此在复杂的样本基质中，采用C18柱直接分离定量比较困难。本研究采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z色谱柱进行分离，在本研究的梯度洗脱下能够将亮氨酸和异亮氨酸有效分离，满足定性和定量的要求。标准溶液的总离子流图见图1。

图1 氨基酸标准品的总离子和特征离子质谱图(MRM)

2.1.3流动相的优化

为了尽可能实现基线分离，提高灵敏度，达到同时检测16种氨基酸的目的，必须对流动相进行优化，试验采用了甲醇-水和乙腈-水2种常用的流动相，为提高氨基酸的离子化效率，分别在水相和有机相中加入10%的200 mmol/L甲酸铵水溶液。为提高亮氨酸和异亮氨酸的分离度，采取改变200 mmol/L甲酸铵水溶液的pH值，分别用甲酸调节pH值为3.0、4.0和5.0进行比较，发现在pH值为3.0时，亮氨酸和异亮氨酸的分离度为1.52，分离效果见图2。满足方法学定量要求。在表1流动相梯度的条件下，运行时间为16 min，能够实现大部分氨基酸的基线分离。

图2 亮氨酸和异亮氨酸的分离情况图

2.2 方法性能

2.2.1线性范围和灵敏度

在本方法试验条件下，通过对氨基酸系列标准溶液进行测定，绘制标样浓度与峰面积的标准曲线。氨基酸标准溶液在(0.012 5～0.25)mmol/L内线性关系良好，根据能够检测出标准物质小麦粉的最低含量，确定本试验的最低检出限和定量限。本试验的线性回归方程、线性系数、检出限和定量限见表4。

表4 16种氨基酸标准溶液的线性关系和检测限

2.2.2准确度和精密度

在本研究的试验条件下，对标准物质小麦粉(GBW(E)100010)进行测定，以小麦粉的标准值为添加量计算回收率；重复6次，考察方法的精密度。具体结果见表5。样品加标回收率79.3%～123.5%，RSD≤7.56%,为了进一步考察方法的准确性，对同一鱼粉样品采用本研究与国标《饲料中氨基酸的测定》GB/T 18246—2000进行检测，相对偏差小于7.56%，具体检测结果见表6。由此可见，方法的准确度和精密度均较好。

表5 标准物质小麦粉试验结果(n=6)

表6 本研究检测数据与国标检测数据比较

3 结论

本研究为饲料中氨基酸的检测提供一种新的途径，在特定的环境条件下，可作为氨基酸检测的选择，该方法准确度和精密度较好,操作较为简单，检测所用时间短，能够适用于饲料中氨基酸的测定。