不同酿造醋的抗氧化性能的对比研究

陈 怡，范茹茹，吴 凯，胡卫东，蒋立文*

(1.湖南农业大学食品科学技术学院， 长沙 410128； 2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，长沙 410128；3.长沙玉和酿造有限公司， 长沙 410129 )

醋作为液态调味品可由单独或混合使用各种含有淀粉、糖的物料或酒精，经微生物发酵酿造而来[1，2]。醋属于5种基本味道之一，在我国有着3 000多年的历史[3]，醋古称为“酢”，别名“醯”，又称苦酒和“食总管”[4]。在我国公元前11世纪就开始制作食醋，《齐民要术》中也谈及了酿醋方面的知识[5]。食醋的分类可分为酿造醋和调配醋，酿造醋又可分为固态发酵醋和液态发酵醋。固态发酵是我国传统食醋的发酵方式之一[6]，它是指一种或多种微生物仅利用潮湿固态天然物料作为培养基的发酵工艺，其本质是以积累目标代谢产物为目的，在特定的发酵条件下，利用微生物对发酵基质中的有机物分解的代谢过程。采用这种发酵方式酿造的食醋具有浓郁的醇香和酯香、酸味柔和、回甜醇厚等特点[7]，如知名的传统发酵醋包括山西老陈醋、镇江香醋、独流老陈醋、四川麸醋都是采用固态发酵的生产方式，并因独特的酿造工艺和风味被冠以地理标志保护产品的名号，列入世界非物质文化遗产[8]。由于地理环境的差异，不同食醋之间的主要酿造微生物种类也不同，这也是使其风味自成一派的原因之一。

酿造食醋中有丰富的营养成分，如多种氨基酸[9]、碳水化合物[10]、维生素、有机酸[11]以及多种挥发性气味[12]。酿造醋还有如杀菌消毒、促进新陈代谢、促进血液循环、开胃消食等功能[13]。随着社会的进步，人们对食品营养保健作用的意识加强，食醋的功能特性受到人们的广泛关注[14，15]。食醋的抗氧化性是食醋保健功能的一个很重要的方面，现有的许多疾病与自由基导致的生物大分子氧化损伤有关[16]，尤其是活性氧如羟基自由基、超氧阴离子自由基等与心脑血管疾病、糖尿病、癌症等有密切关联[17，18]。研究表明：陈醋与香醋中含有较高的抗氧化成分，并且其抗氧化活性很强，这与其酿造原料中的内含物有很大的关系[19]；带皮壳的杂粮醋对DPPH·的清除能力和总抗氧化作用比去皮壳杂粮醋高，这与壳中所含的多酚类物质有密切的关系[20]。抗氧化活性物质，无论是对食品还是生物体都具有很重要的作用，但是由于测定抗氧化活性的方式不同，所得到的结果差异较大，且没有一种单一且有效的试验方法可以用来精确评价抗氧化活性，所以需要通过多种试验方法、统计方法来完整地评价抗氧化活性。本试验在市面购买了12种不同类型、不同时间的陈酿醋，并对其总多酚、黄酮含量以及总抗氧化、DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子清除率进行测定，通过相关性、主成分分析等统计方法进一步分析抗氧化性能的变化规律及特点，为食醋的抗氧化性以及保健功能的深度挖掘提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品清单如表1。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；芦丁、没食子酸购于成都曼思特生物科技有限公司；福林酚购于合肥博美生物科技有限责任公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅购于天津市泰斯特仪器有限公司；752型紫外可见分光光度计购于上海光谱仪器有限公司；岛津AUY220微量分析天平。

1.3 方法

1.3.1 总多酚含量的测定

参考刘东波等[21]与张强等[22]的方法，略有改动，采用Folin-酚比色法进行测定。标准溶液制备、供试品滤液的制备以及标准曲线的绘制与参考文献[21]和[22]一致。在765 nm波长处测出吸光度A(absorbance)值，拟合的标准曲线方程为：y=0.113 3x+0.016 5，相关系数r2=0.997 1(图1)。样品含量测定：吸取供试品溶液3份，每份0.5 mL置于10 mL比色管中，按照同样方法分别测吸光度(A)。从而计算出其含量。

总多酚含量(mg/L)=总多酚含量测得值×样品稀释倍数×滤液稀释倍数

表1 样品清单Tab.1 The sample list

注：上述信息均来自产品标签。产品执行标准号：GB/T18187固态发酵

Note:The above information is from the product label. Product implementation standard number:GB/T18187 solid fermentation

图1 没食子标准曲线Fig.1 Standard curve of polyphenol

1.3.2 总黄酮含量的测定

参考白立敏等[23]的方法略有改动，采用硝酸钠-硝酸铝比色法测定。对照品溶液的制备:精确称取芦丁对照品40 mg，置于100 mL容量瓶中，加60%乙醇40 mL后置于25 ℃水浴，超声辅助使其完全溶解，放冷后用该乙醇稀释定容。供试品溶液的制备与标准曲线绘制的操作与参考文献[23]一致，在波长510 nm处测吸光度值(A)。标准回归方程为y=0.009 8x+0.001 2，相关系数r2=0.999 1(图2)。样品含量测定：精确吸取供试品溶液3份，每份0.5 mL置于10 mL容量瓶中，按上述试验方法分别测吸光度值(A)，计算出总黄酮的含量。

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Standard curve of rutin

1.3.3 羟自由基(·OH)清除率的测定

根据刘东波等[21]的方法略有改动。损伤管A1：5 mmo1/L的邻二氮菲溶液1.5 mL，加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液2.0 mL，充分混匀后，加入7.5 mmol/L的FeSO4溶液1.0 mL，立即混匀后再加入1.0 mL/L的H2O21.0 mL，以蒸馏水补充至10 mL，37 ℃水浴保温1 h，在510 nm处测定吸光度。未损伤管A0：与上述方法差别在不加H2O2和提取物。试样溶液管A2：在损伤管测完后加入12种不同醋液1 mL。按下式计算清除率:

·OH清除率(%)=(A2-A1)×100%/(A0-A1)

式中:A0为未损伤管的吸光度；A1为损伤管的吸光度；A2为试样溶液管的吸光度。

1.3.4 DPPH·清除率的测定

取1.5 mL样品液于试管中，加入2 mL 2×10-4mol/L的DPPH·溶液，混合均匀，反应30 min后在513 nm处测定其吸光度，同时测定样品空白以及不加样品液的空白吸光度。按下式计算其对DPPH·抑制率：

抑制率(%)=[A0-(A1-A2)]×100%/A0

式中：A1为1.5 mL DPPH·溶液+1 mL样品液的吸光度；A2为1 mL样品液+1.5 mL无水乙醇的吸光度；A0为1.5 mL DPPH·溶液+1 mL无水乙醇的吸光度。

1.3.5 超氧阴离子(O2-·)清除率的测定

抗超氧阴离子自由基测定按照南京建成生物工程研究所试剂盒所描述的方法(表2)进行。按下式计算抗超氧阴离子。

抗超氧阴离子(U/L)=标准品浓度×1 000 mL

×样品测试前稀释倍数×(A对照-A测定)/(A对照-A标准)

表2 抗超氧阴离子自由基的测定操作步骤Tab.2 Procedure for determination of anti-superoxide anion free radical

注:混匀，静置10 min，波长550 nm，光径1 cm，双蒸水调零，测定各管吸光值

Note:Blending, place 10 min, the wavelength of 550 nm, 1 cm diameter, double distilled water zero, determine the absorbance values

1.3.6 总抗氧化能力的测定

总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)测定按照南京建成生物工程研究所试剂盒所描述的方法(表3)进行。按下式计算。

表3 总抗氧化能力测定操作步骤Tab.3 Operation steps of determination of T-AOC

注：混匀，放置10 min，波长520 nm，1 cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光值

Note:Blending, place 10 min, the wavelength of 520 nm, 1 cm diameter, double distilled water zero, determine the absorbance values

1.4 数据分析

试验平行测定3次，采用SPSS18.0、Excel2003、origin9.0软件对其数据进行数理统计分析与相关性分析，采用降维法对酿造醋的抗氧化性能进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 总多酚、总黄酮含量变化

12种不同的酿造食醋的总多酚、总黄酮含量变化如图3和图4所示。

图3 不同酿造醋样品中总多酚含量变化规律Fig.3 Changes of total polyphenols in different vinegar samples

图4 不同醋根据多酚高低含量顺序排列的总黄酮含量变化Fig.4 The content of total flavonoids in different vinegar ranged according to the content of polyphenols

高粱、小麦、大米、豌豆等植物含有丰富的多酚类物质，因此由这些作为酿造原料的食醋也有大量多酚类物质的存在[28]。现有大量试验证明，多酚类物质具有较强的抗氧化作用以及抗感染、抗血管疾病等功能[29]。依次测定12种酿造醋的总多酚含量，按照图1中标准曲线进行计算，图3为按照不同品牌酿造醋中总多酚含量的高低排序的结果，可以看出，不同品牌总多酚类物质有显著差异，但均表现出产品标注酿造年份最长的总多酚含量明显高于相同品牌的其他醋。从各自品牌醋来看，每一个系列不同年份按照总多酚含量排列顺序为Z10>Z3>Z6，C5>C3，S10>S5>S3，D8>D5>D4>D3。可从中得知，山西老陈醋、四川麸醋随着陈酿时间增长，其中多酚类物质含量越高，与这桂青等[26]和闫霞等[27]对山西陈醋抗氧化性的研究基本一致，镇江香醋中Z3与Z6的总多酚含量差距不大，但Z10明显高于Z3与Z6，这一结果与沈志远等[28]对镇江香醋的功能性研究结果基本一致。酿造醋中的多酚物质最初存在于原料中，在熏醅和陈放过程中发生美拉德反应生成还原性产物，可能是导致同产品醋随着陈酿年限增长，多酚含量增多的主要原因[29]。同为产品标注3年陈酿的4种醋总多酚含量为C3>S3>Z3>D3，3年陈酿的四川麸醋C3的总多酚含量为(3 870.20±193.11) mg/L高于山西陈醋S3的总多酚含量(3 252.40±112.20)mg/L，且显著高于镇江香醋Z3以及独流老陈醋D3，此结果与马锦锦等[35]研究结果基本一致。不同品牌结果差异大与生产配料、发酵工艺等有关。

黄酮具有抗氧化活性，可以清除自由基并且可抑制肠道中的革兰氏阳性肠球菌的生长和繁殖[36]，黄酮类化合物具有抗炎症、抗肿瘤[31]以及降血脂和保护心脏的作用[32]。黄酮含量按照图2中标准曲线进行计算，图4与图3的排列方式一致，且发现不同醋的总多酚含量变化趋势与其总黄酮含量趋势相同，这与乔艳霞等[33]的研究，酿造醋中的总黄酮含量与总多酚含量有较强相关性的结论相符。从图4中可以得知,总多酚和总黄酮的含量具有明显相似的变化趋势,最高值Z10的总黄酮含量为(161.292±8.06) mg/L,而最小值D5的总黄酮含量为(59.120±2.86) mg/L。山西老陈醋总黄酮含量的变化趋势为S10>S5>S3，与总多酚趋势一致，这一结果与闫霞等[27]在对山西老陈醋中总酚、黄酮等进行研究时，得到的两者与抗氧化效果呈显著正相关的结果一致。同为产品标注3年陈酿的4种醋总黄酮含量为C3>S3>Z3>D3，3年陈酿的四川麸醋C3的总黄酮含量为(110.210±5.11) mg/L，高于山西陈醋S3的总黄酮含量(100.780±5.04) mg/L，且要明显高于镇江香醋Z3和独流老陈醋D3。

2.2 总抗氧化能力变化

12种不同酿造食醋的总抗氧化能力按照不同品牌表现的变化规律如图5所示。

图5 不同酿造醋总抗氧化能力变化规律Fig.5 The variation of total antioxidant capacity of different brewing vinegar

从图5中可以看出，不同品牌不同年份的醋按照总抗氧化能力值从高到低排列顺序为Z10>Z3>Z6，C5>C3，S10>S5>S3，D4>D8>D3>D5。四川麸醋、镇江香醋和独流老陈醋的总抗氧化能力变化趋势与其总黄酮和总多酚的排列顺序一致。

2.3 DPPH·、·OH、O2-·清除率的变化

12种不同酿造食醋按照酿造年份从长到短排序的DPPH·和·OH、O2-·清除率的变化如图6所示。

从图中可知：镇江香醋的3种自由基清除率都呈现出Z10>Z6>Z3；Z10、Z6、Z3的超氧阴离子清除率(%)分别为(223.300±11.16)、(135.55±6.78)、(129.610±6.74),DPPH自由基基清除率(%)分别为：(390.528±19.52)、(387.220±19.33)、(363.436±18.17),羟基自由基清除率(%)分别为：(93.500±4.53)、(91.010±4.55)、(87.000±4.35)。其数据变化不仅符合自由基清除率强度随酿造年份的增长而增强的规律，也与总黄酮、总多酚含量以及总抗氧化能力一致，表明3种自由基清除率之间存在相关性。山西老陈醋的超氧阴离子与DPPH自由基清除率的增减趋势相同，均为S3>S10>S5。其中S3的超氧阴离子、DPPH自由基清除率(%)分别为(371.290±18.56)、(80.860±4.04),明显高于另外两种年份。羟基自由基清除率的增减趋势为S10>S3>S5，其中S3与S5的数值差距不大，S10的数值为(179.160±8.95)%,显著高于以上2种。独流老陈醋的超氧阴离子与羟基自由基清除率的变化都符合D5>D4>D8>D3的趋势，独流老陈醋8、5、4年的超氧阴离子自由基清除率相差较小，而3年的明显低于这3种年份。DPPH自由基清除率的增减趋势为D5>D8>D4>D3，其中最大清除率与最小清除率相差(24.330±1.21)%。四川麸醋的3种自由基清除率都呈现出C5>C3的趋势，C5与C3的的超氧阴离子、DPPH自由基、羟基自由基清除率(%)分别为：(382.590±19.12)、(94.720±4.73)、(153.710±7.68)，(353.524±17.67)、(72.410±3.62)、(122.020±6.10)，且数据相差较大，表明随着酿造年限增长导致其自由基清除率的强度变大的趋势明显，其变化规律与总抗氧化能力、总黄酮含量以及总多酚含量的变化趋势一致。

图6 不同醋的DPPH·、O2-·、·OH清除率的变化Fig.6 Change in DPPH· ,superoxide anion and hydroxyl free radical scavenging rate of vinegar

选取产品标注酿造年限同为3年的不同品牌的4种醋发现，超氧阴离子和羟基自由基清除率的变化趋势一致，均为S3>Z3>C3>D3,这说明这2种自由基清除率存在很大的相关性[21]。

2.4 抗氧化相关性分析

表4采用Pearson’s相关系数分析了各个品牌酿造食醋随着酿造年限的增长，其中的自由基清除性能与总多酚、总黄酮含量具有相关性，结果表明：随着酿造年限的增长，镇江香醋的总多酚、总黄酮、·OH清除率互为极显著正相关，总多酚含量和O2-·清除率、DPPH自由基清除率互为显著相关；山西老陈醋的总多酚、总黄酮、·OH清除率互为极显著相关，O2-·清除率与总多酚与总黄酮含量显负显著相关；随着酿造年限的增长，独流老陈醋的O2-·清除率与DPPH·清除率互为极显著相关，总多酚、总黄酮互为极显著相关，·OH清除率分别与DPPH·清除率和O2-·清除率互为显著性相关。研究表明，天然抗氧化剂主要来源于植物多酚，其中以黄酮类的化合物最为常见，其共同结构为C6-C3-C6[34]，因此这3种醋的总多酚和总黄酮均显示为极显著相关。自由基(O2-·、·OH)和DPPH·的氧化与机体内的电子链传递有很高的相关性[35]，这也可能是这3种自由基互相之间有较高的相关性的原因之一。

表4 自由基清除能力与总多酚和总黄酮含量的相关性分析Tab.4 Correlation analysis of free radical scavenging ability and total polyphenols and flavonoids content

注：**P<0.01，表示相关性极显著；*P<0.05，表示相关性显著

Note:**P<0.01 indicates extremely significant correlation;*P<0.05, indicating significant correlation

2.5 抗氧化性能主成分分析结果

由图7可知，五种不同的抗氧化指标在主成分分析图上有较好的分类，羟基自由基、总多酚、总黄酮为一类，超氧阴离子、DPPH自由基为第二类。主成分1(principal component 1，PC1)、主成分2(principal component 2，PC2)分别解释了变量76.13%、17.37%，累贡献率为93.5%,因此这2个主成分能够代表整体数据的基本信息特征。O2-·清除率和DPPH·清除率聚集在第一象限，这一类与PC1、PC2成很高的正相关性，即在PC1、PC2坐标正向，PC1、PC2越大，O2-·清除率和DPPH·清除率取值越大。第二类聚集在第四象限，说明与PC2成很高的负相关性，即在PC2坐标正向，PC2越大，·OH清除率、总多酚、总黄酮取值越小。上述变量均在PC1上成很好的正相关性,且总多酚含量、·OH清除率与PC1相关性最高，说明二者对酿造醋中抗氧化性能的贡献最高。

图7 抗氧化性能的主成分分析Fig.7 Principal component analysis of antioxidant properties

3 讨论

近年来，抗氧化物质的研究在食醋或者其他食品领域应用广泛，但是由于测定抗氧化活性的方式不同所得到的结果差异较大，且没有一种单一且有效的试验方法可以用来精确评价抗氧化活性，所以需要通过多种试验方法、统计方法来完整地评价抗氧化活性[36]。本试验对4类共12种不同年份的酿造醋中的总多酚、总黄酮、总抗氧化能力和3种自由基(·OH、DPPH·、O2-·)清除率进行了分析，评价酿造食醋的抗氧化能力,结果发现，镇江香醋、四川麸醋、山西老陈醋的总黄酮含量、总多酚含量以及总抗氧化能力都随着产品标注的陈酿年限增长而增加，这与弓耀忠等[37]得出的山西老陈醋中的抗氧化物质在生产中熏醅阶段大量产生，陈酿阶段得以富集的结论一致。且在比较产品标注同为3年的醋时，发现麸醋的总黄酮、总多酚含量与其他醋相比都为最高，其总抗氧化能力值也较高，这可能与麸醋在酿制过程中使用了大量的麦麸，其中含有丰富的酚酸类化合物、黄酮类化合物以及维生素E。且麸醋是四大名醋中唯一采用药曲作为糖化发酵剂的药醋，其中加入当归、砂仁、肉桂、红梅、陈皮等中草药[38，39]。独流老陈醋、四川麸醋和镇江香醋的3种自由基(·OH、DPPH·、O2-·)清除率的变化趋势一致，山西老陈醋在上述6种抗氧化活性指标的测定排序中都处于前列，这与山西老陈醋在酿造过程中的熏醅脱不开关系。有研究发现熏醅有利于老陈醋的抗氧化活性，熏醅中美拉德反应产生的类黑精及溶解性多酚可为其抗氧化活性提供重要的贡献[40，41]。试验通过相关性分析表明，上述几种酿造醋的总多酚、总黄酮含量、总抗氧化能力以及3类自由基清除能力均显示为极显著相关。主成分分析表明，DPPH·清除率、·OH清除率与PC1相关性最高，说明二者对酿造醋中抗氧化性能的贡献最高。