趋化因子CXCL5调控NF-κB与Wnt/β-catenin信号通路抑制肿瘤免疫促进胃癌的机制研究

刘立，盖金娜，尹作文，陈琴华

0 引言

胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位居全球肿瘤发病率和死亡率的第二位[1-2]。胃癌的早期诊断率低，临床诊治时常被延误[2-3]。肿瘤标志物的出现为早期胃癌的诊断带来了新的希望[4-5]。虽然目前已发现多种用于胃癌检测的肿瘤标志物，但其特异性均不高，敏感度也不甚理想[6]。晚期胃癌患者的临床治疗手段仍以化疗为主，至今仍没有公认的治疗标准[7-8]。近些年，免疫治疗已成为肿瘤研究的热点，多项研究提示免疫治疗在未来的肿瘤治疗中有巨大前景[8-10]。报道指出，多种细胞因子在肿瘤免疫中发挥作用，已被用于肿瘤的免疫治疗[11-12]。CXC趋化因子配体-5（CXC chemokine ligand-5,CXCL5），又称为上皮中性粒细胞活化肽78（ENA78），是CXC趋化因子家族的成员之一[13-14]。作为炎性介质，CXCL5对中性粒细胞有很强的趋化作用[15]。此外，CXCL5可与其特异性受体CXCR2结合，介导一系列生物学效应进而影响肿瘤的生长与转移[15]。研究指出，CXCL5与非小细胞肺癌、膀胱癌、肝癌等的发生与发展密切相关[16-19]。而CXCL5在胃癌中的确切作用机制尚无报道，本研究探讨CXCL5对胃癌肿瘤免疫的影响及其潜在分子机制。

1 资料与方法

1.1 资料来源

本研究共纳入华中科技大学协和深圳医院胃肠外科于2018年7月—2019年4月收治的83例胃癌患者作为研究对象进行回顾性研究；患者年龄在23～79岁之间，平均年龄51.3±13.8岁；所有患者中男55例、女28例。所有患者均为首次被诊断为胃癌，均经病理学或影像学（或内镜）确诊。排除复发性胃癌患者、放化疗史的患者、并发其他恶性肿瘤的患者、近期服用影响机体免疫药物的患者、伴有全身感染性疾病的患者、临床资料不全无法进行统计的患者、伴有严重脏器功能障碍的患者、妊娠期或哺乳期女性。胃癌患者的基本信息见表1。

另选取同期在我院体检科体检的健康者40 例作为对照；年龄在29～67 岁之间，平均年龄48.6±14.1岁，其中男27例、女13例。两组年龄与性别相比差异均无统计学意义（均P＞0.05），有可比性。所有纳入者均签署知情同意书，均知晓本研究的目的与方法，本研究获得医院伦理委员会批准。

表1 83例胃癌患者的基本信息Table 1 Basic data of 83 gastric cancer patients

1.2 材料与设备

DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素（美国Hyclone公司）。人胃癌细胞株SNU216和小鼠胃癌细胞株MFC购自武汉大学细胞库。Lipofectamine®2000转染试剂（美国Thermo Fisher公司）。小鼠淋巴细胞分离液（深圳达科为生物技术有限公司）。人CXCL5 ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）。重组人CXCL5蛋白（上海美迪西生物医药股份有限公司）。SDS-PAGE试剂（上海生工生物工程股份有限公司）。CXCL5抗体、CXCR2抗体、p-ERK1/2抗体、p-MAPK抗体、p-β-catenin抗体（美国Santa Cruz公司）；p-PI3K抗体、p-AKT抗体、p-NF-κB抗体（美国CST公司）；MAPK抗体、PI3K抗体、NF-κB抗体、β-catenin抗体（美国Abcam公司）；ERK1/2抗体、AKT抗体、β-actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。NF-κB信号通路抑制剂BAY 11-7082（美国MCE公司），Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939（美国Selleckchem公司）。流式细胞术抗体：FITC标记的CD4抗体、APC标记的CD8抗体、FITC标记的CD56抗体、PE标记的CD16抗体（美国BioLegend公司）。pLVX-Tight-Puro质粒（美国Invitrogen公司）。Taq酶（武汉擎科生物技术有限公司）。内切酶BamHⅠ与EcoRⅠ（美国Thermo Fisher公司）。T4 DNA连接酶（日本TaKaRa公司）。C57小鼠购自武汉大学实验动物中心。主要设备有生物安全柜、CO2培养箱、垂直电泳仪、化学发光成像系统、流式细胞仪、Tecan酶标仪等。

1.3 酶联免疫检测CXCL5水平

分别抽取胃癌患者和健康者的空腹静脉血10 ml，置于促凝管中，自然凝固，2600 r/min离心15 min，取上清液储存于-80℃备用。CXCL5 ELISA试剂盒检测血清中CXCL5的水平，检测过程严格按照产品说明书进行。用Tecan酶标仪测量450 nm处的OD值。绘制标准曲线，计算CXCL5浓度。

1.4 Western blot检测 CXCL5、CXCR2及NF-κB、β-catenin、ERK和PI3K/AKT信号通路

取新鲜或-80℃冻存的患者肿瘤组织、癌旁正常组织和小鼠肿瘤组织，碾磨后用含cocktail蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行裂解，超声后12000 r/min离心，取上清液即为总蛋白。贴壁细胞用PBS润洗，吸弃后加入含cocktail蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行裂解，收集裂解液，超声后12000 r/min离心，取上清液即为总蛋白。组织与细胞样品的蛋白浓度均用BCA试剂盒进行测定。SDS-PAGE电泳用5%的浓缩胶与12%的分离胶进行，每孔上蛋白样80～100 μg。电泳后将蛋白转至PVDF膜，用5%BSA封闭，一抗4℃孵育过夜。洗涤，二抗室温孵育，洗涤，DAB显色。

1.5 免疫组织化学染色检测CXCL5与CXCR2

采用SP法检测胃癌患者肿瘤及癌旁正常组织中CXCL5与其受体CXCR2的表达。将10%甲醛溶液固定过夜的组织进行石蜡包埋与切片，所有切片常规脱蜡至水，加0.01 mol/L枸橼酸缓冲液（pH6.0），用高压锅进行抗原热修复，加3%H2O2室温避光孵育30 min，PBS洗涤3次。滴加10%的正常非免疫羊血清，37℃孵育60 min，PBS洗涤3次。滴加CXCL5或CXCR2一抗工作液（稀释比例为1:50），4℃孵育过夜，PBS洗涤3次。滴加二抗工作液（稀释比例为1:200），37℃孵育60 min，PBS洗涤3次。滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉卵白素，37℃孵育60 min，PBS洗涤3次。用DAB显色、苏木精对比染色、脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下观察，每个切片随机选取5个视野进行拍照。用Image Pro Plus软件计算阳性染色的平均吸光度。

1.6 质粒构建与稳定表达细胞株建立

根据人CXCL5的mRNA序列（NM_002994.5）和pLVX-Tight-Puro载体图谱，设计引物序列，上游引物：5’-CCGGGATCCATGAGCCTCCTGTCCAGC-3’（BamHⅠ）；下游引物：5’-CCCGGTAGAATTCGTTTTCCTTGTTTCCACC-3’（EcoRⅠ）。从人胃癌细胞株SNU216中提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，根据Taq酶的说明书进行PCR扩增。扩增产物经鉴定、纯化后备用。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶对pLVX-Tight-Puro质粒进行双酶切，酶切产物经鉴定、纯化后备用。根据T4连接酶的说明书将cDNA扩增产物与酶切质粒进行连接，连接产物经转化与鉴定后提取质粒备用。pLVX-CXCL5质粒构建成功后根据pLVX-Tight-Puro的说明书包装慢病毒。慢病毒感染SNU216或MFC细胞，用嘌呤霉素筛选稳定表达CXCL5的细胞。

1.7 小鼠移植瘤模型的建立

将30只C57小鼠随机分为CXCL5过表达组和对照组，每组15只。将对数期生长的稳定过表达CXCL5或对照小鼠胃癌MFC细胞消化、离心、PBS重悬、计数后调整细胞浓度至1.0×107/ml，无菌条件下将细胞接种于C57小鼠左前肢腋窝结合部皮下，每只0.1 ml。接种后第3天起隔天记录各小鼠的肿瘤大小，绘制肿瘤生长与生存曲线。用Western blot分析各组小鼠肿瘤组织中CXCL5、磷酸化NF-κB与磷酸化β-catenin的表达水平。分离小鼠胃癌移植瘤细胞。用流式细胞术检测移植瘤中CD4+T细胞、CD8+T细胞与CD56+CD16+NK细胞比例。

1.8 流式细胞术检测CD4+T、CD8+T与CD56+CD16+ NK细胞

分离小鼠胃癌移植瘤组织切块，置于RPMI1640培养基中消化过夜、研磨、过不锈钢网过筛，经PBS洗涤后制成单细胞悬液，计数并将细胞浓度调整到1.0×107/ml，取0.5 ml细胞悬液加入离心管。根据抗体的使用说明书将待测抗体（CD4、CD8、CD56或CD16）以适当比例加入离心管中。涡旋混匀并将离心管置于避光处室温孵育30 min。低速离心机1500 r/min离心5 min后弃上清液，并用PBS洗涤3次。再次弃上清液后加入0.3 ml的PBS重悬。涡旋混匀后上流式细胞仪进行检测。

1.9 统计学方法

所有数据分析均采用SPSS20.0进行。采用Graph Pad Prism 5.0进行作图。计数资料用频数和百分比（n（%））表示，计量资料用均数±标准差（>）表示。采用t检验或Mann-Whitney U检验分析两独立样本之间的差异，采用χ2检验或Fisher精确检验进行计数资料分析。所有统计学分析均为双尾检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌患者血清及组织中CXCL5水平分析

共纳入83例胃癌患者。ELISA分析显示胃癌患者的血清CXCL5水平为（263.1±37.9）ng/L，显著高于健康者的（158.6±18.3）ng/L。Western blot与免疫组织化学分析显示，胃癌患者肿瘤组织中的CXCL5及其受体CXCR2的水平均显著高于癌旁正常组织，见图1。

2.2 CXCL5水平与临床特征的关系

根据患者肿瘤组织中CXCL5的表达水平，以所有患者的平均吸光度值为界限将所有患者分为CXCL5低表达组（CXCL5Low）与CXCL5高表达组（CXCL5High）。CXCL5低表达组26例、CXCL5高表达组57例。胃癌患者中CXCL5高表达与CXCL5低表达组的年龄、性别、组织学类型与浆膜浸润相比差异均无统计学意义（均P＞0.05）。CXCL5高表达组患者的分化程度显著低于CXCL5低表达组（P＜0.05），淋巴结转移、肝转移和TNM分期均显著高于CXCL5低表达组（均P＜0.05），见表2。

2.3 CXCL5对胃癌细胞信号通路的影响

Western blot显示CXCL5过表达能显著增加SNU216与MFC细胞中p-NF-κB与p-β-catenin的表达水平，而不影响p-ERK、p-PI3K与p-AKT的表达水平，见图2A。进一步分析显示，重组CXCL5蛋白（rCXCL5）也能显著增加SNU216与MFC细胞中p-NF-κB与p-β-catenin的表达水平，见图2B。

2.4 小鼠模型的建立与分析

与对照组相比，CXCL5过表达组胃癌移植瘤小鼠的肿瘤体积显著增高（P＜0.05），见图3A；生存期显著降低（P=0.006），见图3B。Westernblot结果显示CXCL5过表达组中CXCL5、p-NF-κB与 p-β-catenin的表达水平均显著高于对照组，见图3C。流式分析结果显示CXCL5过表达组中CD4+T细胞、CD8+T细胞与CD56+CD16+NK细胞数量均显著低于对照组，见图3D～E。

表2 CXCL5的表达与胃癌患者临床特征的关系Table 2 Relation between CXCL5 expression and clinical characteristics of gastric cancer patients

3 讨论

胃癌的病理学发生机制涉及多种基因与信号通路的改变，而其确切的发病机制尚未被完全阐明。因此，进一步研究胃癌的发病机制，寻找新的生物指标和治疗靶点至关重要。CXCL5可通过其ELR功能区与CXCR2结合，进而介导肿瘤的生长、浸润与转移[15-16]。研究指出，CXCL5与非小细胞肺癌、膀胱癌、肝癌等的发病机制密切相关[16-18]。多项报道指出胃癌患者的血清CXCL5水平高于健康者[19]。而CXCL5在胃癌中的确切作用机制尚无报道。本研究结果显示，胃癌患者血清与肿瘤组织中的CXCL5水平均出现显著升高。同时，与对照组小鼠相比，过表达CXCL5组胃癌移植瘤小鼠的肿瘤体积显著增高，生存期显著降低。这些结果提示CXCL5可能参与胃癌的发生与发展机制。

图1 胃癌患者血清(A)及肿瘤组织(B,C)中的CXCL5水平Figure 1 Expression of CXCL5 in serum(A) and tumor tissues(B,C) of gastric cancer patients

图2 CXCL5过表达对胃癌细胞信号通路的影响Figure 2 Effect of CXCL5 overexpression on signal pathways of gastric cancer cells

胃癌肿瘤组织中NF-κB的表达水平显著高于癌旁正常组织，且NF-κB的表达与胃癌的分化程度和淋巴结转移密切相关[20]。Wnt/β-catenin信号通路作用广泛，Wnt/β-catenin信号通路亦与胃癌密切相关[21]。近年的研究发现，多种靶向Wnt/β-catenin信号通路的治疗均能有效抑制胃癌细胞的增殖与转移[21]。本研究中CXCL5过表达与重组CXCL5蛋白处理均能显著增加SNU216与MFC细胞的p-NF-κB与p-β-catenin的表达水平，而不影响p-ERK、p-PI3K与p-AKT的表达水平，提示CXCL5可能通过NF-κB与Wnt/β-catenin信号通路发挥促胃癌的作用。

免疫治疗利用肿瘤的免疫学特性杀灭肿瘤细胞和肿瘤组织[9-10]，现已成为肿瘤治疗的热点之一[8]。肿瘤的免疫治疗通过调动宿主的免疫系统，使宿主对肿瘤的杀伤能力增强，进而消灭肿瘤细胞[8-9]。研究指出，与健康者相比，胃癌患者免疫细胞（如CD4+T细胞等）的数量均出现显著降低[22]。本研究中，CXCL5过表达组胃癌移植瘤小鼠的肿瘤组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞与CD56+CD16+NK细胞的数量均显著低于对照组。因此，CXCL5可能通过NF-κB与Wnt/β-catenin信号通路发挥抑制胃癌肿瘤免疫的作用。

综上所述，胃癌患者肿瘤组织及血清中CXCL5水平均显著升高，CXCL5可能通过激活NF-κB与Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌的肿瘤免疫活性进而发挥促进胃癌的作用。

图3 CXCL5过表达对胃癌移植瘤小鼠模型的影响Figure 3 Effect of CXCL5 overexpression on xenograft model of gastric cancer