HPLC检测不同配比三七-黄连药对中3种成分的溶出率△

陈雪平，郭丽娜，王单单，田会东，裴媛，王瑞*

1.漯河市中心医院 药学部，河南 漯河 462300；2.武汉大学 基础医学院，湖北 武汉 430000

三七是五加科人参属植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen.的干燥根和根茎，性甘,微苦。在《本草新编》中被称作“止血之神药”；其化学成分主要是达玛烷型皂苷、黄酮类、氨基酸等，如人参二醇型皂苷、原人参三醇型皂苷三七[1]。三七具有散瘀止血、消肿定痛的生物活性，临床上主要用于治疗咯血、吐血、崩漏、外伤出血、跌扑肿痛等[2]。黄连CoptischinensisFranch.是毛茛科黄连属多年生草本植物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、抗氧化等药理作用，临床用于黄疸、高热神昏等[2]。三七与黄连是临床上常用的药对之一，我国传统的以三七、黄连为主药的中药复方制剂有中药复方三七贝连蜜糊[3]、苦参黄连汤[4]、复方三七饮[5]、三七芪连汤[6]等。药对是中药复方最常用的配伍形式，组成简单却具备中药复方配伍的基本特点，是以中医药理论为指导，并经过长期临床实践证明行之有效和有一定组合法度的两对相对固定中药的配对，通过配伍组合发挥协同增效或配伍减毒等作用[7]。虽然三七-黄连药对在临床上广泛应用，但目前两者的配伍比例鲜有报道。研究表明药对的不同配比对有效成分的溶出率有较大影响[8-11]。三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1是三七总皂苷的主要活性成分，检测三者的含量对三七-黄连药对的质量评价具有重要意义[12]。因此，本实验设计了9个三七-黄连的配比，研究不同配比下三七-黄连药对中主要活性成分的溶出率变化规律，并从化学成分视角探讨最佳配比，为后续研究奠定基础。

1 仪器与试药

LC-20A岛津高效液相色谱仪、DGU-20A3R在线脱气系统、全波长色谱工作站、SPD-M20A光电二极管阵列紫外-可见光检测器、SIL-20AC自动进样器、CT0-20AC柱温箱(日本岛津公司)；台式高速离心机(16K，珠海黑马医学仪器有限公司)；超声波清洗器(SB25-12D，宁波新芝生物科技股份有限公司)；电子分子天平(JY，上海衡平仪器仪表厂)；纯水仪(Milli-Q，美国Millipore公司)。

三七皂苷R1对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110745-201820，纯度：93.1%)；人参皂苷Rb1对照品(斯坦福分析化学公司，批号：GSB-107939，纯度：98.34%)；人参皂苷Rg1对照品(斯坦福分析化学公司，批号：GSB-705891，纯度：99.87%)。三七和黄连购自安徽。经漯河市中心医院药学部于晓涛主任鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相为乙腈(A)-水(B)，线性梯度洗脱(0～25 min，2%～20%A；25～50 min，20%～45%A；50～60 min，45%～70%A；60～65 min，70%～70%A；65～70 min，70%～2%A)；流量为1.0 mL·min-1；柱温35 ℃；检测波长203 nm；进样体积10 μL。

2.2 样品制备

2.2.1供试品样品制备 三七和黄连按照1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、4∶1、3∶1、2∶1、0∶1共9种不同比例分别精密称取2味中药，每个比例均为10 g，于500 mL圆底烧瓶中加20倍量水，浸泡2 h。加热回流提取1 h，过滤，转移到离心管中，99×g离心10 min，取上清液置于250 mL容量瓶中，加水定容，摇匀。精密吸取2 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤，-20 ℃保存备用。

2.2.2对照品溶液的制备 精密称取适量，水溶解定容于1 mL容量瓶中，摇匀，制成的混合对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，-20 ℃保存，备用。

2.2.3HPLC检测 分别取上述制备的样品各10 μL，注入HPLC色谱仪，按2.1项下的色谱条件检测，色谱图见图1。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取2.2.2项下的混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于10 mL容量瓶中，水定容，摇匀。精密吸取10 μL注入HPLC色谱仪，在2.1项下的色谱条件检测。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的线性回归方程，分别是Y=3 944 200X+25 079.6(0.40～0.18 mg·mL-1，r=0.999 6)、Y=5 381 900X+185 331.0(0.1～0.68 mg·mL-1,r=0.999 6)和Y=4 117 930X+149 098.0(0.16～0.70 mg·mL-1,r=0.999 6)。r均大于0.999，表明线性方程在检测范围内线性关系良好。

注：A.对照品；B.黄连；C.三七；D.三七-黄连配伍比为1∶1；E.三七-黄连配伍比为1∶2；F.三七-黄连配伍比为1∶3；G.三七-黄连配伍比为1∶4；H.三七-黄连配伍比为2∶1；I.三七-黄连配伍比为3∶1；J.三七-黄连配伍比为4∶1；1.三七皂苷R1；2.人参皂苷Rg1；3.人参皂苷Rb1。图1 三七-黄连不同配伍比的HPLC图

2.4 系统适用性

取上述制备的混合对照品溶液的中间浓度，按2.1项下的色谱条件检测，计算理论塔板数(N)，N=16(tR/w)2(tR是保留时间，w是化合物基线的峰宽)，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1的理论塔板数分别是125 685、105 813、46 178；拖尾因子(T)，T=w0.05/2 d(w是化合物基线的峰宽，d是峰前沿到峰顶点之间的距离)，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1的拖尾因子分别是1.041、1.006、0.970，3个化合物的拖尾因子都在0.95～1.05，符合2015年版《中华人民共和国药典》规定。取中间浓度的混合对照品溶液，用水稀释到适当浓度，按2.1项下的色谱条件检测，当信噪比分别为3和10时，此时对应化合物的浓度分别为检测下限和定量下限，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1的检测下限分别是0.860、0.052、2.037 μg，定量下限分别是2.860、0.174、6.790 μg，3个化合物的浓度都大于定量下限，表明该方法系统适用性良好。

2.5 精密度

日内精密度：取上述制备的混合对照品溶液高、中、低3个浓度，每个样品连续进样6次，在2.1项下的色谱条件检测，计算连续6次的RSD；日间精密度：同样取混合对照品溶液的高、中、低3个浓度，每个样品每天连续进样2次，连续进样3 d，在2.1项下的色谱条件检测，计算6次进样的RSD，如表1所示，表明精密度良好。

2.6 稳定性

取上述制备的混合对照品溶液高、中、低3个浓度，分别在0、2、4、8、16、24 h通过2.1项下的色谱条件检测，计算RSD，如表1所示，表明供试品溶液24 h稳定。

2.7 重复性

按2.2.1项下方法制备三七-黄连质量比为1∶1的供试品溶液6份，在2.1项下的色谱条件检测。计算3份供试品溶液的平均含量的RSD，结果如表1所示，表明该方法重复性较好。

2.8 加样回收率

精密量取三七-黄连质量比为1∶1的供试品溶液6份，每份1 mL，分别加入已知量的对照品，制备供试品溶液，在2.1项下的色谱条件检测，计算加样回收率，结果见表1。

表1 HPLC检测三七-黄连药对中3种成分含量的方法学考察(n=6)

2.9 结果

2.9.1有效成分溶出率 按2.1项下检测的9个三七-黄连不同配比的含量，计算有效成分溶出率，公式如下，结果见图2～4和表2。

单一成分的溶出率=(该化合物在提取物中的含量/
该化合物对应生药材的取样量)×100%

(1)

三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1溶出率随不同比例的变化趋势分别见图2～4。由图2可知当三七-黄连配伍比为1∶4时，三七皂苷R1的溶出率最好，当三七-黄连配伍比为1∶2时，人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的溶出率最好。

图2 不同配伍比例三七-黄连药对中三七皂苷R1溶出率变化

图3 不同配伍比例三七-黄连药对中人参皂苷Rg1溶出率变化

图4 不同配伍比例三七-黄连药对中人参皂苷Rb1溶出率变化

表2 三七-黄连不同配伍比例下3个成分的溶出率(n=3) %

2.9.2最优配比结果 以三七-黄连药对中3个有效成分为考察指标，采用“归一化法”处理数据，通过Hassan法进行数学转化，计算各指标的“归一值”，公式如下[13]：

di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

(2)

再通过各指标的“归一值”，得到总“归一值”(A)，公式如下[14-15]：

A=(d1×d2……×dn)1/n

(3)

结果如表所示。由表3可知，当三七-黄连配伍比为1∶4时，3种成分的溶出率最好，配伍比为3∶1时，三者的溶出率最差。

表3 三七-黄连不同配伍比例下3个成分的总评归一值

3 讨论

研究结果显示，不同配伍比例的三七-黄连药对对有效成分的溶出影响较大。其中R1的溶出率随黄连比例的升高而增加，Rg1和Rb1的溶出率随黄连的比例升高先增加后降低，当三七-黄连配伍比为1∶2时，两者的溶出率最大。本研究选取的3个成分属于三七-黄连药对的主要药效物质，被《中华人民共和国药典》列为对应药材的质量控制性指标。因此，以三者的溶出率为指标进行最优配比关系考察具有一定的代表性。通过计算三七-黄连不同配比条件下3个成分溶出率的总评归一值，发现当三七-黄连比例为1∶4时，三者的总溶出率最大，为3∶1时有成效成分的总溶出率最差。

本研究从化学成分的角度对中药药对三七-黄连最佳配比关系进行了研究，在以后的科研工作中，将从药效学的视角做进一步的探讨，为三七-黄连药对的最佳配伍比例的确定提供参考。