小花清风藤及其同属药用植物近红外光谱鉴定研究△

孙庆文，温迪，郭文凯，王波，徐文芬

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

小花清风藤SabiaparvifloraWall.ex Roxb.为清风藤科清风藤属植物，国内主要分布于贵州西部及西南部、云南东南部至西南部、广西西部及西南部、四川等地。除此，印度、缅甸、尼泊尔、菲律宾、泰国、越南、印度尼西亚也有分布[1]。黔西南的苗族、布依族等少数民族常用小花清风藤的茎藤治疗肝炎、风湿痹痛、跌打损伤等疾病[2]。现代研究表明，小花清风藤及同属多种植物主要含有黄酮类、生物碱类及三萜类成分，具有明显抗乙肝病毒、保肝、降酶、抗炎等作用[3-8]。十余年来，笔者在国家自然科学基金、贵州省一流学科建设等多个项目的支撑下，对清风藤属药用植物的资源、鉴定、栽培、质量以及化学药理等方面进行了系统研究[9-13]。在长期的研究过程中，笔者发现小花清风藤与同属(清风藤属)的簇花清风藤S.fasciculataLecomte ex L.Chen、尖叶清风藤S.swinhoeiHemsl. ex Forb. et Hemsl.等物种在植物形态上极为相似，在没有花、果的情况下不易准确鉴别，容易导致药农在采集小花清风藤药材时出现混杂，从而影响临床疗效，甚至埋下安全隐患。因此，探索准确、快速、简便的鉴别方法，无疑是小花清风藤及其同属植物综合开发利用和药材质量控制的重要课题。

近红外光谱(NIRS)技术具有操作简便、精密度高、无毒无损、分析时间短等特点[14]。将该技术应用于中药材鉴别、中药生产检验、药用植物品种鉴定等方面已取得良好效果。朱斌等[15]采用近红外光谱结合聚类分析法对20种金丝桃属植物进行近红外漫反射光谱法鉴别；刘沭华等[16]采用红外光谱法结合近邻法和多类支持向量机等模式识别技术，对白芷、丹参药材的产地进行鉴别研究，均取得了良好的鉴别效果；孙荣梅等[17]采用近红外漫反射光谱结合移动窗口偏最小二乘法(Moving-window Partial Least Square，mwPLS)波段选择进行主成分分析，建立了一种对菟丝子及其同属混淆药材的可靠鉴别方法。近年来，NIRS技术得到了飞速发展，已被广泛应用于农业、食品、石化和药物分析等领域。鉴于该技术的突出优势，笔者对7种清风藤属植物共20批60份样品的NIRS特征进行分析研究，以期建立小花清风藤及其同属药用植物的NIRS鉴别方法，为该类药材的鉴定和质量控制提供参考。

1 材料

样品为清风藤科清风藤属植物的干燥叶、1年生茎、老茎(多年生)，共7个种60批样品(小花清风藤属叶、1年生茎、老茎各20份)，样品均由贵州中医药大学药学院的孙庆文教授鉴定为正品，凭证标本存放于贵州中医药大学生药重点实验室。材料信息见表1。

Thermo Antaris Ⅱ型傅里叶变换近红外光谱仪(美国赛默飞公司)；InGaAs检测器以及石英杯、100目标准检验筛、QE-200高速万能粉碎机(浙江屹立工贸有限公司)。数据分析软件：Result光谱采集软件、TQ Analyst 8.0 化学计量软件、SPSS 22.0软件。

表1 供试药材来源信息

2 方法

2.1 样品的处理

取低温干燥的样品，粉碎，过六号筛(100目筛)，样品质量>15.0 g，密封，放入干燥器中备用。

2.2 光谱数据采集

取样品约10.0 g，置于采样杯中，在仪器预热30 min后，使用Result软件，漫反射模块采集NIRS谱图。采集条件：扫描样品时间30 s，扫描范围10 000～4000 cm-1，分辨率为8 cm-1，样品扫描3次。

2.3 数据处理

由于清风藤属植物所含化学成分较复杂，而且NIRS谱图自身有重叠现象，以致于难以从原始谱图找到种间和种内的差异。通过对所有样品的谱图进行9点平滑并对其用二阶导数、标准正态变换和多元散射校证等方法处理，消除基线漂移和噪声干扰，应用TQ Anlyst 8.0化学计量学软件分别对小花清风藤叶、1年生茎、老茎的NIRS数据进行相似度计算，将相似度值导入SPSS 22.0软件中选择欧式距离法进行系统聚类分析。分别绘制3个药用部位的系统聚类分析图。

3 结果与分析

3.1 NIRS特征分析

原始谱图结果(见图1～3)，从图中发现只有叶的NIRS原始谱图在波数4 139.50～7 381.78 cm-1区域部分样品差异较为明显，1年生茎和老茎NIRS原始谱图的峰形、峰高都非常相似，无明显差异。经二阶导数处理后，不仅漂移和噪音得到消除，还能够更清晰地反映样品的特征信息(见图4～6)。在波数4 139.50～7 381.78 cm-1的差异性较原图更为明显，有利于物种的区分。

图1 20批清风藤属植物叶NIRS原始谱图

图2 20批清风藤属植物1年生茎NIRS原始谱图

图3 20批清风藤属植物老茎NIRS原始谱图

图4 20批清风藤属植物叶NIRS二阶导数谱图

图5 20批清风藤属植物1年生茎NIRS二阶导数谱图

图6 20批清风藤属植物老茎NIRS二阶导数谱图

3.2 NIRS相似度计算结果与分析

将60批样品的光谱数据分别导入TQ anlyst 8.0化学计算软件，采用相关系数分析法分别计算叶、1年生茎、老茎各样品NIRS之间的相似度，所得结果见表2～4。

通过SPSS 22.0软件分别对小花清风藤不同药用部位的种内和种间NIRS相似度数值进行种内的单因素方差分析和种间的多重比较，发现叶的NIRS相似度值种间差异更显著。对小花清风藤叶种内的NIRS相似度进行单因素方差检验，发现种内的NIRS相似度的数值差异无统计学意义(P>0.05)，说明小花清风藤叶片的种内化学成分比较稳定。对小花清风藤1年生茎和老茎种内的NIRS相似度进行单因素方差检验，发现种内的NIRS相似度的数值差异无统计学意义(P>0.05)，但与同属其他物种比较时差异有统计学意义(见表5～8)。在对小花清风藤与其他同属植物的种间NIRS相似度进行多重比较发现差异有统计学意义(P<0.05)，说明小花清风藤与同属的其他物种间的化学成分差异有统计学意义，有利于对物种进行分类和鉴别(见表9～11)。

表2 小花清风藤及其同属植物叶片近红外光谱相似度计算结果 %

表3 小花清风藤及其同属植物1年生茎近红外光谱相似度计算结果 %

表4 小花清风藤及其同属植物老茎近红外光谱相似度计算结果 %

表5 小花清风藤叶种内NIRS相似度单因素方差检验

表6 小花清风藤1年生茎种内NIRS相似度单因素方差检验

表7 小花清风藤老茎种内NIRS相似度单因素方差检验

从3个药用部位的NIRS相似度结果方差分析来看，叶片NIRS相似度比其他2个药用部位的种内差异更小，种间差异更大。在种内比较时，小花清风藤叶、1年生茎和老茎的NIRS相似度分别为91.78%、83.41%和91.85%。在种间比较中，小花清风藤叶与同属其他物种的种间NIRS平均相似度只有61.73%，相似度值差距明显，说明小花清风藤与其他同属植物叶的化学成分差异较大，有利于对其进行鉴别。1年生茎和老茎的NIRS相似度比较中，小花清风藤与同属其他物种的1年生茎和老茎的NIRS相似度分别达到了79.39%和86.86%，NIRS相似度值相差不大，说明该属植物茎中的化学成分较为相近。以上结果可以看出，叶片的NIRS相似度值差异较大，这对小花清风藤药材鉴定具较大的参考价值。

表8 小花清风藤叶种间相似度多重比较(n=60)

注：P<0.05差异有统计学意义。

表9 小花清风藤叶种内和种间NIRS相似度均值

注：—表示种内样品未比较，下同。

表10 小花清风藤1年生茎种内和种间NIRS相似度均值

表11 小花清风藤老茎种内和种间NIRS相似度均值

3.3 NIRS聚类分析

分别选择小花清风藤及其同属植物3个药用部位4 139.50～7 381.78 cm-1NIRS数据，导入SPSS 22.0软件，以欧式距离对样品进行系统聚类分析，构建3个药用部位的系统聚类树状图，并结合NIRS相似度的结果和植物的形态学进行分析，从叶片的聚类树状图中可见，当欧式距离为10时，可将小花清风藤及其同属植物叶聚类分为四大类，A类包括6个样，B类包括5个样，C类包括3个样，D类包括6个样(见图7～9)。A类：小花清风藤和簇花清风藤聚在一起，但在欧式距离为5时又分为2类，5份小花清风藤能够聚在一起；B类：尖叶清风藤5个样完全聚在一起；C类：属于1个小类，只有平伐清风藤2个样品和云南清风藤1个样品聚为一类；D类：分为了2个小支，3份四川清风藤样品聚在一起，3份鄂西清风藤样品聚在一起。

图8 小花清风藤及其同属植物1年生茎NIRS聚类分析图

图9 小花清风藤及其同属植物老茎NIRS聚类分析图

综合上述结果分析，通过对小花清风藤及其同属植物叶的NIRS的聚类分析，小花清风藤、尖叶清风藤、四川清风藤、鄂西清风藤都能较好的区分开，可以对该属植物达到分类鉴定的目的；然而，对1年生茎和老茎进行聚类分析，结果显示物种间的聚类相对比较混乱，而且两部分聚类不能得出一致的聚类结果，聚类结果与植物种类、采集时间和地点没有形成一定的规律，从NIRS相似度来看，未能得到相吻合的结果。可能是因为植物茎的生长年限不同，积累的化学成分也会有所差异。而在采样过程中植物茎的生长年限不易准确判断，故通过茎的NIRS相似度和聚类分析，无法起到较好的分类鉴别作用。

4 小结与讨论

本研究选取小花清风藤及其同属植物作为研究对象，经干燥样品研磨过100目筛，通过对粉末样品的扫描，采集所有样品的NIRS数据，应用TQ Anlyst 8.0化学计量软件处理，结合SPSS 22.0统计软件的系统聚类分析方法来对物种进行鉴定研究，建立了一种方便快捷、无损害的鉴定方法。

在对NIRS谱图的分析中发现，由于样品都属于同属物种，化学结构和化学组成都比较近似，因此原谱图之间的差异不是很明显，只发现在部分波数处(4 139.50～7 381.78 cm-1)具有微小的差异。通过对谱图进行二阶导数处理，此波数范围内的吸收峰比原图明显，一些微小的变化二阶导数图比原图更能说明问题。

叶部位的NIRS相似度比较和聚类分析结果显示，小花清风藤与同属植物间差异十分显著，故可以通过对该属植物叶的近红外光谱的采集和分析，建立有效的小花清风藤与其同属植物及药材分类鉴别的快捷方法。对比小花清风藤与其他物种的1年生茎和老茎中的NIRS数据发现其相似度较高，不能完全区分开，说明该属植物1年生茎和老茎的化学成分比较相似，NIRS数据不适宜作为该属植物的分类鉴别依据，这可能是因为清风藤属大部分物种属于多年生落叶植物，叶的生长周期较短，因而种内化学成分相对稳定，而种间又有所差异。1年生茎和老茎的生成周期较长，即使是同一种植物，可能由于生长期和采集时间的不同，会导致茎中的化学成分有所差异。