基于系统生物学的中医证候研究进展

卢冬雪，刘峰，严晶，孙志广

综述

基于系统生物学的中医证候研究进展

卢冬雪1，2，刘峰3，严晶1，孙志广1

1.南京中医药大学，江苏 南京 200032；2.南京中医药大学第二附属医院，江苏 南京 210017；3.南京市浦口中医院，江苏 南京 210031

“证候”是中医领域研究的核心问题，但中医证候缺乏客观、量化指标制约中医学的发展和中医现代化的进程。代谢组学、基因组学、蛋白质组学构成了系统生物学的主要研究内容，其灵魂在于“整合”，与中医学“整体观”异曲同工。基于系统生物学挖掘中医证候的本质，使中医证候的辨识更具有可信度。本文综述近年来系统生物学在中医证候研究中的应用。

系统生物学；中医证候；客观化；整体观；本质；代谢组学；基因组学；蛋白质组学；综述

辨证论治是中医的特色和精髓，而“证”的辨识是辨证论治的核心，是承接中医理法方药的关键[1]。传统中医学的现代化是当下医学发展不可逆转的趋势，缺乏可客观量化指标，对疾病本质的揭示相对落后，限制了中医药向国际发展的进程。系统生物学在生命科学研究领域的发展如火如荼，在中医药领域被广泛地应用[2]。兹就相关研究作一综述。

1 “证候”定义

“证候”是机体在疾病不同阶段病理变化的本质概括。中医学的“有诸内必形诸外”从另一角度说明外在功能表现对应内在物质基础的本质[3]。“证候”的内涵伴随着“证候”本质不断揭示被现代医学进一步挖掘。宋剑南[4]将其定义为一种特定时空下生理、病理信息的综合。基于证候要素方面：“每一种证候都是若干证候要素及其靶位的结合，病因、病机即为证候要素，证候要素发生部位则为证候要素靶位。”[5]“证”的本质被不断深化与现代科学化。

2 系统生物学概念

“系统生物学”是整体研究生物体内氨基酸、蛋白质、代谢物等之间的生物学过程，并辅助以生物学和高通量技术的学科[6]。整合、信息、干涉是其特点，换言之，其研究的是在人为控制的状态下，揭示出特定的生命系统的动态的动力学特征[7-8]。

3 “证候”本质与系统生物学

已有不少研究针对证候标准化、客观化问题进行了深入探索，在肾本质[9]、脾虚证本质[10]、血瘀证本质[11]等方面获得成果，但中医的整体观与恒动观无法用西医还原论解释。中医药的量化、客观化在系统生物学推动下飞速发展，其从DNA、mRNA、蛋白质、代谢物等不同层面探索，综合体现了现代医学整合思想和个体化的医疗手段[12-13]，其科学内涵相通于中医学治未病、整体观、辨证施治、理法方药等基础理论。中医学“有诸内必形诸外”等基础理论已在中医某些证候（寒热证、脾虚证、肾阳虚证）上得到验证。采用血、尿、粪等生物样品，系统生物学从不同组学层面阐明了对应“群”“组”“谱”的调节规律与中医辨证全身病理状态间的相关性[14-17]。因此，基于系统生物学的中医证候量化和现代化研究理论上可行[18]。

4 系统生物学与“证候”本质相关性研究

4.1 转录组学技术

转录组学是在特定时期和特定生理状态下，挖掘整体水平上的细胞、组织的总数基因组质和量的表达和转录情况，并揭示其相关规律的一门学科[19]。从广义层面来说，是指总数基因表达和转录的RNA总和，包括信使RNA（mRNA）和非编码RNA（ncNRA），而在狭义层面则专门指编码蛋白质的mRNA。Jiang等[20]采用Human LncRNA Microarray V3.0分析不同证候肺结核患者lncRNA表达谱，结果lncRNA表达存在差异的肺阴虚证有566个，气阴两虚证有60个，肝火伤阴证有55个（Fold change＞2，＜0.05）。KEGG通路分析提示差异表达基因关联于Hippo信号通路和蛋白质的消化吸收。王阶等[21]研究不稳定型心绞痛血瘀证候，以血塞通治疗并观察其对miR-146b-5p、miR-199a-5p及其富集的干预抗原呈递和处理通路、p53信号通路和NK细胞介导的细胞毒性作用通路靶基因（KIR3DS1，HLA-DPB1，TP53SESN2，NCR1，PRF1）的影响，结果显示miR-146b-5p、miR-199a-5p可作为诊断潜在生物标志物，且靶基因的变化提示上述3条信号通路可被miR-146b5、miR-199a-5p影响。廖江铨[22]采用高通量测序筛选冠心病血瘀证相关基因表达谱，从转录组学层面探索冠心病血瘀证的病理机制和证候本质，为研究冠心病血瘀证的生物标志物和活血化瘀的作用靶点提供客观依据。

4.2 代谢组学技术

代谢组学是反映生物体代谢功能在疾病或药物影响下所表现出的不同代谢模式的一门科学，其主要通过测定生物体各种不同体液内代谢产物的组成和变化来鉴定。血、尿、粪、唾液等是代谢组学的主要生物学样本。代谢组学的核心就是代谢物的检测、分析与鉴定，目前主要的技术手段包括核磁共振（NMR）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）等。陈德轩等[23]通过胶带表皮剥脱加金葡菌菌液注射致大鼠疮疡模型，收集正常组与模型组大鼠血浆与尿液并进行代谢轮廓分析。结果显示，主成分分析图和正交偏最小二乘-判别分析图均可看出实验模型大鼠血浆、尿液图谱与正常组大鼠图谱存在差异，两者明显区分。马琪[24]通过通过建立湿热泄泻大鼠模型，并运用白头翁汤进行治疗，运用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间-串联质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术进行代谢组学检测大鼠血和尿液的差异性代谢产物相关通路和筛选代谢标志物。结果显示，共有7种差异性代谢产物和17种潜在的代谢标志物，白头翁汤中有45个活性成分，作用靶点166个及相关疾病343种。提示白头翁汤可能是通过调节湿热泄泻大鼠机体内血清生物标志物7-酮基脱氧胆酸、创伤酸和五羟色胺的含量，并通过调控血清甘油酯代谢、初级胆酸合成和色氨酸的代谢通路从而起到治疗湿热泄泻的目的。王佳婕等[25]核磁共振氢谱（1H-NMR）定量检测慢性复发型溃疡性结肠炎（UC）虚、实证患者血浆代谢物含量。筛选出潜在生物标志物共10种，其中UC患者乙酰乙酸、丙酮水平明显高于健康人，而肌肽、乳酸、异亮氨酸、丙氨酸则显著低于健康者。慢性复发型UC患者血清中苏氨酸、葡萄糖、肌肽表现为大肠湿热证患者高于脾胃气虚证患者，缬氨酸、丙氨酸及甘氨酸则在脾胃气虚证患者较高。由此得出结论，慢性复发型UC虚、实证患者有较明显的糖、氨基酸及脂质代谢紊乱，UC辨证分型有明显的代谢物质基础。Zhao等[26]运用UPLC-Q-TOF/MS技术研究不同证型（血瘀证和痰浊证）冠心病（CHD）患者，结果显示，CHD及健康人有26种差异性代谢物（VIP＞1.5，＜0.5），这些代谢产物涉及与能量、氨基酸和炎症等有关的代谢通路，而CHD血瘀证和痰浊证可由其中的19种差异性代谢产物辨证出来。罗朵生等[27]运用UPLC-Q-TOF/MS技术实时监测高脂血症大鼠造模期间尿液代谢产物的改变，发现随着造模时间的延长，模型组大鼠代谢产物构成出现明显质的变化，表明这些代谢产物可能与高脂血症密切相关，由此通过探索其差异性物质的变化进一步挖掘高脂血症发病机制。Xie等[28]运用UPLC-Q-TOF/MS技术探索临床健康者血清胆汁酸代谢谱，发现与胆汁酸代谢谱相关的影响因素有年龄、性别、体质量指数，由此得出临床实践中研究不同疾病的胆汁酸病理生理变化时应将这3个因素纳入考虑范围。张少强等[29]应用UPLC-Q-TOF/MS技术，分析CHD不同证型患者与健康人血浆中内源性小分子代谢物。结果显示，与正常人比较，CHD不同证型患者存在柠檬酸、丙氨酸和组胺3种差异性代谢物质，其中丙氨酸和组胺代谢水平呈上升趋势，而柠檬酸代谢水平呈下降趋势。表明CHD患者存在脂肪酸代谢、氨基酸代谢和组胺代谢途径的紊乱。西旺等[30]通过代谢组学研究方法观察四物汤对自然衰老小鼠体内代谢物、代谢通路的影响，运用UPLC-Q-TOF/MS技术对小鼠血浆进行分析。表明四物汤影响自然衰老小鼠血浆中的代谢物是通过谷胱甘肽代谢、嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等途径，从而改善小鼠衰老过程中的代谢紊乱，为该复方后续干预衰老物质基础研究提供了生物学信息。

4.3 蛋白质组学技术

蛋白质组学是一门通过研究分析微观的细胞、基因组或宏观的组织所表达的生物体蛋白质构成及其变化规律的学科，以研究证候形成的物质基础为前提条件，进一步分析整体蛋白质的表达水平，从中挖掘出证候的本质[31]。欧阳秋芳等[32]采用真武汤治疗心肾综合征阳虚水泛证患者，检测治疗前后血清蛋白质指纹图谱，与健康对照组比较，真武汤干预后异常表达蛋白表达变为正常者视作阳虚水泛证标志性蛋白质。王端等[33]收集60例抽动障碍（TD）患儿（气郁化火证34例、脾虚痰聚证26例）及30例健康儿童，检测血清蛋白峰值，分析差异蛋白峰。结果显示，TD组与健康对照组间差异蛋白峰8个，差异均有统计学意义（＜0.001）。2个差异蛋白峰存在于气郁化火证与脾虚痰聚证患儿之间（＜0.001）。李依洁[34]采用TMT蛋白组学技术分析温肾健脾法干预脾肾阳虚型腹泻型肠易激综合征大鼠结肠组织和海马组织主要差异蛋白的变化。结果发现3个主要蛋白（Gsk3b、Wbp11和Tgm2）和3个次要蛋白（Acss2、Cox6b1和Mrpl12），并发现有6个信号通路的改变，分别为Metabolic pathways、Ribosome、Alzheimer disease、Oxidative phosphorylation、Huntington’s disease和Spliceosome。赵静[35]应用iTRAQ标记蛋白组学技术分析比较单纯高脂高糖喂饲以及高脂高糖喂饲联合链脲佐菌素（STZ）的2型糖尿病大鼠模型中医证候和血清蛋白组学特征。结果显示，共有差异蛋白97个（上调37个、下调60个）、无明显变化蛋白32个存在于高脂高糖组与高脂高糖联合STZ组之间，差异蛋白涉及116条生物学途径，13条存在显著差异的信号通路，差异蛋白质相互作用网络有2个；与高脂高糖组比较，高脂高糖联合STZ组大鼠血清HSP71、PPKARIA、FXII、FCN2蛋白表达明显上调，a1I3蛋白表达明显下调，而UN13D、LBP蛋白表达未见显著差异。刘雄等[36]采用同位素相对标记与TMT联合2D-LC-MS/MS，筛选系统性红斑狼疮（SLE）合并激素性股骨头坏死（SANFH）筋脉瘀滞证、肝肾亏虚证患者与健康人之间的血清差异蛋白质，共筛选出10个表达差异倍数在2倍以上显著表达的蛋白质。其中IGHV3-7、IGHV1OR15-1、ABCB9、FGB、F13A1、FGG、FGA筋脉瘀滞组显著表达；SAA1、ACTB、CRP肝肾亏虚组显著表达。表明IGHV3-7、IGHV1OR15-1、ABCB9、FGB、F13A1、FGG、FGA可能是SLE合并SONFH筋脉瘀滞证潜在的血清特异性蛋白标志物，SAA1、ACTB、CRP可能是SLE合并SONFH肝肾亏虚证潜在的血清特异性蛋白标志物。

4.4 基因组学技术

基因组学是一门从整体层面对基因的多样性、基因组的表达及功能、蛋白质产物的功能进行的明确阐释，从而揭示生物体内所有基因之间的关系及所有基因在染色体上的结构、位置功能的学科。汪梅姣[37]基于基因芯片表达技术比较脾虚型痛风人群与正常人群之间的差异基因。结果显示，研究组与正常组比较，509个基因表达上调，911个基因表达下调。提示脾虚型痛风患者体内与免疫系统有关的基因表达发生改变。汪洋[38]通过代谢组学层面研究类风湿关节炎（RA）脾虚证患者，其粪便代谢产物为脾虚证RA基因组学提供了研究基础，并分析该表达谱的差异。结果显示，差异表达基因共633条存在于脾虚型RA患者和健康人之间，其中上调和下调的基因分别有201条和432条，涉及25条基因功能和37条信号通路，主要参与炎症、蛋白质代谢、神经内分泌免疫性疾病。孙丙银等[39]采用基因组学分析70例激SANFH患者，经PCR-LDR检测，得出SANFH“瘀”证与CYP1A2、G2964A结合位点AG＋GG基因型具有较大关联性，而其结合位点的突变AA基因型是SANFH“虚”证发生的危险因素。翁莉等[40]以非肝肾阴虚患者作为对照组，研究肝肾阴虚证的基因表达谱并分析了差异表达基因。结果显示，肝肾阴虚证较对照组存在差异基因表达特征图谱，从基因组学角度进一步证实人体出现非正常状态是由于基因在mRNA和/或蛋白质水平上发生改变而导致的。

5 小结

基因和蛋白质的变化提示机体状态会如何转变，而代谢物质和代谢表型反映的是当前的机体状态，其直接展现了生物体系中机体的生理和生化功能状态。“证候基因组谱”“证候蛋白质组谱”“证候转录组谱”“证候代谢组谱”的构建，为中医证候的客观化、标准化、量化及证候本质的相关研究提供了新的技术支持，因此，从系统生物学层面挖掘中医证候本质已成为可能。

目前，基于系统生物学的思路和方法在中医证候研究上虽已取得了一定成果，但由于绝大多数实验研究手段采用单一的组学技术，而各组学在研究目的、内容及手段上不尽相同，导致难以深刻反映系统生物学在思路和技术上的整合性，因此，中医证候研究尚未取得实质性的突破。应综合各大组学技术开展研究，全面整合数据，建立证候的诊断模型，达到精确、量化地预测证候类型，为中医证候的本质研究提供理论和实验基础。

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Research Progress in TCM Syndromes Based on Systems Biology

LU Dongxue1,2, LIU Feng3, YAN Jing1, SUN Zhiguang1

“Syndromes” have always been the core issue of research on TCM field, However, lack of objective and quantifiable indexes of TCM syndromes have restricted the development and modernization of TCM. Metabolomics, genomics, and proteomics constitute the main research contents of systems biology. Its soul lies in "integration", which is similar to the "holistic view" of TCM. Based on the nature of TCM syndromes in systems biology, the identification of TCM syndromes is more credible. This article systematically reviewed the research progress of systems biology in TCM syndromes.

systems biology; TCM syndromes; objectivity; holistic view; essence; metabolomics; genomics; proteomics; review

R2-05；R228

A

1005-5304(2020)06-0131-05

10.3969/j.issn.1005-5304.201904078

国家自然科学基金（81673795、81503536、81603578）

孙志广，E-mail：pr_zhiguangsun@163.com

（2019-04-05）

（2019-04-29；编辑：华强）