减压结合1-甲基环丙烯处理通过调控中华寿桃能量代谢控制其采后冷害

曹继璇，张颖，娄湘琴，车炎，刘畅，彭勇，石晶盈*

1(山东农业大学 食品科学与工程学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东 泰安，271018) 2(山东省淄博市淄川区检验检测中心，山东 淄博，255100)

中华寿桃(PrunuspersicaL. cv. Zhonghuashoutao)是我国培育出的晚熟优质的桃品种，成熟后的颜色为鲜红色，着色面积达到80%以上，口感较脆，糖分较高，深受消费者的喜爱。但是在采后冷藏时，容易产生冷害，一般冷害症状在低温下不显现，当转移到常温下，会很快表现出果肉褐变、棉化等现象[1]，使其失去新鲜水果的风味，货架期变短，丧失商品价值[2]。因此，在低温贮藏过程中，防止冷害发生，提高果实贮藏期和货架品质已经成为中华寿桃贮藏保鲜技术中亟需解决的问题。

减压是一种物理贮藏技术，通过降低贮藏环境中的气体压力，给果实创造一个低氧环境，并补充果实所需要的水分。同时在减压过程中能够抑制微生物的生长，杀灭果实中的昆虫和细菌，还可通过减少不利于果实贮藏的生理病害发生率来提高贮藏期及货架期果实的品质[3]。有研究发现，减压处理可以提高杨梅和水蜜桃等果实的贮藏品质[4-5]，减轻冬枣的冷害[6]。1-甲基环丙烯(1-methylcyclopropene, 1-MCP)是一种乙烯抑制剂，能够抑制乙烯的感受和信号传导，在许多果实中，都有很好的保鲜效果[7]。近年来，1-MCP在控制西葫芦、桃子等果蔬冷害方面的研究被陆续报道[8-9]。除此之外，热处理[10]、采后预冷处理[11]、气调贮藏[12]、一氧化氮[13]等在中华寿桃的贮藏保鲜中也有相关研究。但是单一的采后处理往往较难达到理想的效果，严重制约了中华寿桃在市场上的供应期，不同技术的结合处理或许能有效的解决这一问题。

研究发现，稳定的能荷水平有助于保持果蔬贮藏和货架期间良好的品质[14]。果蔬采后运输和贮藏期间的机械碰撞、微生物侵染等，均会导致果蔬的能量消耗增加，对病原菌和一些物理伤害的抵抗力下降，从而加速果实冷害和病害的发生，降低贮藏品质，缩短了贮藏时间[15-16]。

本研究从能量代谢角度探讨了减压处理、1-MCP处理以及减压结合1-MCP处理对中华寿桃贮藏品质的影响，为提高桃果实贮藏保鲜效果，减少其采后损失提供实践基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 中华寿桃

试验所用八成熟中华寿桃采摘于山东省淄博市沂源县。果实大小、形状、成熟度一致，无病虫害和机械伤。在20 ℃下预冷24 h后低温贮藏，贮藏温度为0 ℃，相对湿度为90%～95%。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

样品随机分为4组，进行如下处理：1-MCP(1 mg/m3)处理，放入1-MCP缓释包(山东营养源有限公司提供)密封，放到0 ℃，相对湿度90%～95%的贮藏环境中贮藏；减压(0.05～0.06 MPa)处理，温度0 ℃，相对湿度90%～95%，减压12 h后，放气后将桃子放入密封袋中，放在0 ℃，相对湿度90%～95%贮藏；减压与1-MCP结合处理，减压处理12 h后，放入1-MCP缓释包密封，放在0 ℃，相对湿度90%～95%贮藏；对照组，不做处理，直接放到相同贮藏环境中贮藏。每个处理设3个重复，每个重复50个桃子。在贮藏期分别为0、30、60和90 d时，以上4种处理中每个重复分别取出10个桃子放入货架温度环境(20 ℃)，并进行取样，测定能量代谢相关指标；货架期放置在20 ℃的环境下，分别放置3 d和6 d。

1.2.2 感官质量评价及褐变程度的测定

参照陆振中等[17]感官评定方法，参照表1所示的评定标准进行评定，每个重复取6个果实，褐变程度观察整个果实以及切开果实进行评定，由10名经过训练的专业人员打分(每次指定的人员统一)，取平均值。分值低于2，则认为失去商品价值。

表1 感官评价标准Table 1 Standard of subjective evaluations

1.2.3 能量水平的测定

称取5 g桃果肉，研磨后加入6 mL 0.6 mol/L高氯酸溶液冰浴提取。4 ℃ 13 000 r/min 离心20 min，取3 mL上清液，用1 mol/L的KOH将pH调节至6.5～6.8。冰浴30 min后过滤，滤液用超纯水定容到4 mL，用高效液相色谱仪进行测定分析。

腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)含量及能荷水平的测定参照LIU等[18]方法并略有修改。色谱条件为反向C18柱(250 mm× 4.6 mm)，检测波长为245 nm，流速0.6 mL/min，柱温30 ℃，进样量为20 μL。流动相A为0.05 mol/L，pH 7.0的磷酸钾缓冲液，流动相B为纯甲醇。都用0.22 μm的纤维滤膜过滤，并用超声波除气泡备用。采用线性梯度洗脱，时间为8 min，延迟2 min，流动相B在第 0、7、10 min时所占比例为0%、20%和0%。根据ATP、ADP、AMP标准品的保留时间对样品峰定性分析。根据制作的标准曲线对样品峰进行定量分析，结果以nmol/gFW表示。根据ATP、ADP和AMP的含量，按照公式(1)计算能荷(enery charge，EC):

(1)

1.2.4 琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH)活性的测定

参照LIANG等[19]方法进行，称取5 g桃果肉，加入20 mL 50 mmol/L预冷的Tris-HCl(pH 7.5)提取缓冲液(含0.25 mol/L蔗糖、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.3 mol/L甘露醇、0.5%聚乙烯吡咯烷酮)研磨至匀浆，过滤后在4 ℃下4 000 r/min离心10 min，取出得到的上清液，4 ℃下13 000 r/min继续离心20 min。向得到的沉淀中加入10 mL 10 mmol/L的Tris-HCl (pH 7.2)洗涤液，重复上面的离心操作，向最终的沉淀加入1.5 mL的悬浮液，得到线粒体粗酶液。(洗涤缓冲液和悬浮液中含0.25 mol/L蔗糖、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.3 mol/L甘露醇)。

参照ACKRELL[20]等的方法略有改动，取5.4 mL的磷酸钾缓冲液(0.2 mol/L，pH 7.4，内含0.2 mol/L的琥珀酸钠)和0.1 mL 0.9 mol/L的2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)混合，在30 ℃下保温5 min，待液体冷却后加入0.1 mL线粒体粗酶液，混匀后加入0.1 mL 硫酸甲酯吩嗪(PMS)启动反应，30 ℃下保温10 min，空白对照为未加酶液的反应体系，测定在600 nm处反应前后的吸光值。以每克鲜重每分钟吸光值变化0.01为一个酶活力单位 U，最终结果以U/g FW 表示。

1.2.5 细胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase,CCO)活性的测定

利用1.2.4中的方法提取线粒体粗酶液，参照ERREDE等[21]等的方法略有改动。取0.4 mL的线粒体粗酶液，加入1 mL 0.04%的细胞色素C和4 mL的蒸馏水混匀，37 ℃下保温2 min。冷却后加入1 mL 0.4%的对苯二胺，在37 ℃水浴下保温10 min，空白对照为未加酶液的反应体系，测定在510 nm处反应前后的吸光值。以每克鲜重每分钟吸光值变化0.01为一个酶活力单位U，最终结果以U/g FW表示。

1.3 数据统计和分析

使用Microsoft Excel 2007整理实验数据，用SigmaPlot 10.0软件作图、计算均值及标准偏差。采用IBM SPSS Statistics 20软件进行数据统计分析，用Duncan新复极差法进行显著性(P<0.05)水平检验。所有试验均包含3次生物重复，每个生物重复进行3次技术重复。

2 结果与分析

2.1 不同处理对中华寿桃贮藏期及货架期褐变程度的影响

果肉的褐变程度是衡量桃子是否发生冷害现象的标准。由图1可以看出，在贮藏期后期和货架期，对照组的桃子均出现长斑腐烂的现象。由于桃子冷害最先表现在果肉中，因此，将桃子切开，发现在贮藏期间，减压结合1-MCP处理与单一处理组的桃子褐变较轻，而对照组的桃子褐变现象严重。将贮藏的桃子转入货架温度环境，经过3 d的放置，桃子的冷害现象更加严重，对照组和1-MCP、减压单独处理组的桃子从果核向周围开始有腐烂现象发生，果肉褐变严重，而经过减压结合1-MCP处理的桃子褐变较轻。这与陈文烜等[4]用减压结合1-MCP处理可显著延缓翠冠梨贮藏期的品质劣变的结果一致。

图1 不同处理对中华寿桃贮藏期60 d和货架期 (60+3) d褐变程度的影响
Fig.1 Effects of different treatments on browning ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao during 60 days of storage and (60+3) days of shelf-life

2.2 不同处理对中华寿桃贮藏期及货架期感官品质的影响

图2为10人评审小组对中华寿桃整体感官质量的评定结果。在贮藏期至90 d时，经过减压结合1-MCP处理的桃子依然有商品价值(感官分值大于2)，而其他处理组的桃子在贮藏期至60 d货架期3 d时，已经失去了商品价值，这与图1结果基本一致。这些结果表明，减压结合1-MCP处理有效地减轻了中华寿桃的冷害，延长了其贮藏期及货架期。

图2 不同处理对中华寿桃不同时期感官品质的影响
Fig.2 Effects of different treatments on the sensory effects ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao in different periods
注：图中a～d分别表示同一时间差异显著性分析，相同小写字母代表 差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.3 不同处理对中华寿桃贮藏期及货架期能量水平的影响

2.3.1 在贮藏期不同处理的果实中ATP、ADP和AMP含量的变化

果蔬采后成熟衰老过程中冷害的发生与能量的损失有着密切的关系[15]。由图3-A可以看出，中华寿桃在贮藏中ATP含量呈先升高后降低的趋势，减压结合1-MCP处理的桃子ATP含量显著高于(P<0.05)其他组。不同处理果实中ADP的含量都呈下降的趋势(图3-B)，其中对照组ADP下降的速度最快，从9.78 nmol/g降低到了4.12 nmol/g，说明减压结合1-MCP处理有效地延缓了ADP含量的下降，促进了贮藏期间果实ADP的积累。在图3-C中，4个处理组AMP含量的变化均呈上升的趋势，对照组的AMP含量上升最快，经减压结合1-MCP处理的果实AMP含量增加最少，说明减压结合1-MCP处理能够有效地抑制AMP的上升。以上研究结果均表明，减压结合1-MCP处理能够使果实维持一个较高的能量水平，从而保证桃子在贮藏期间的能量供应，减轻果实在贮藏期间的冷害。SAQUET等[22]认为，果蔬采后衰老和冷害褐变的发生可能与能量的供应不及时和生成速度的下降有很大关系。陈京京等[23]研究也发现桃果实冷害发生可能与能量缺失有密切联系。SAQUET等[22]指出在梨组织中能量在维持细胞膜的完整性中有很大的作用。引起梨果心褐色的主要因素是ATP的下降或者是能量的损失，ATP参与了果实脂质的合成与脂肪链的去饱和，因此，较高的ATP含量有利于保持膜的完整性，提高果实的抗逆性[24]。这与本研究的结果一致，说明减压结合1-MCP处理可以通过维持较高的ATP水平来提高果实的抗冷性。

A-ATP含量；B-ADP含量；C-AMP含量
图3 不同处理对中华寿桃贮藏期ATP、ADP和AMP含量变化的影响
Fig.3 Effects of different treatments on ATP、ADP and AMP content ofPrunuspersicaL.cv.Zhonghuashoutao during storage

2.3.2 在货架期不同处理的果实中ATP、ADP、AMP含量的变化

将贮藏不同时间的桃果实放入货架温度(20 ℃)下3 d和6 d，经过减压结合1-MCP处理的中华寿桃ATP的含量均显著高于(P<0.05)单一处理组和对照组(图4-A和图4-D)，ADP的含量也显著高于(P<0.05)其他组(图4-B和图4-E)。AMP的含量变化均呈上升趋势，且减压结合1-MCP处理组的AMP含量均低于其他处理组(图4-C和图4-F)，这与图3-C贮藏期间AMP含量的变化一致。表明减压处理和减压结合1-MCP处理在贮藏后期的货架期中都可以抑制AMP的上升，但是从整个贮藏期和货架期期间来看，减压结合1-MCP处理具有更佳的效果，能够维持较高的ATP和ADP水平，显著降低AMP的含量。

A-货架期+3 d ATP含量；B-货架期+3 d ADP含量；C-货架期+3 d AMP含量；D-货架期+6 d ATP含量；E-货架期+6 d ADP含量； F-货架期+6 d AMP含量
图4 不同处理对中华寿桃货架期ATP、ADP和AMP含量变化的影响
Fig.4 Effects of different treatments on ATP、ADP and AMP content ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao during shelf life

2.4 不同处理的果实贮藏期及货架期间能荷的变化

由图5-A可以看出，减压结合1-MCP处理组的最高能荷水平为69.5%，而对照组的能荷水平最高值则为64%，并且在整个贮藏期间，结合处理组的平均能荷值比对照组高9.8%，结合处理组的能荷水平显著高于(P<0.05)对照组。在货架期内(图5-B和5-C)，经过减压结合1-MCP处理的果实的能荷水平也显著高于(P<0.05)对照组，对照组的能荷水平最低，能量亏损也最严重。能荷水平的变化趋势与ATP的变化趋势相似，这与前人的研究结果一致[25]。以上结果说明，经过减压结合1-MCP处理的果实在整个贮藏期和货架期间，能荷都维持在较高的水平，为果实提供能量，减轻果实的冷害。这与张苗等[26]发现通过冷激结合甜菜碱处理西葫芦可维持较高的能荷水平从而减轻西葫芦的冷害的研究结果一致。

A-贮藏期能荷；B-货架期+3d能荷；C-货架期+6d能荷
图5 不同处理对中华寿桃贮藏期和货架期能荷的影响
Fig.5 Effects of different treatments on energy charge ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao during storage and shelf life

2.5 不同处理对中华寿桃贮藏期及货架期间SDH酶活性的影响

SDH酶是线粒体的一种标志酶，为线粒体内膜的结合酶，它不但能为呼吸链提供电子，还能连接氧化磷酸化与电子传递。不同处理在贮藏期间对果实SDH活性的影响如图6-A所示，在整个贮藏过程中，SDH活性的变化呈先上升后下降的趋势。对照组果实品质劣变较快，在贮藏前期就呈现下降的趋势，其他3个处理在前30 d，SDH活性有着缓慢上升的趋势，在贮藏至30 d开始下降。在贮藏后期，虽然整体呈下降的趋势，但单一处理组和结合处理组显著高于(P<0.05)对照组，尤其是经过减压结合1-MCP处理的中华寿桃，在整个贮藏期都保持着较高的SDH活性，如图6-B和图6-C所示，在货架期间，果实的SDH活性整体呈下降的趋势，对照组在货架期间的SDH活性都很低，减压结合1-MCP处理能够很好的保持较高的SDH活性水平，从而维持了果实内能量水平，减轻了果实冷害，对果实起着较好的保鲜作用。

A-贮藏期SDH活性；B-货架期+3 d SDH活性；C-货架期+6 d SDH活性
图6 不同处理对中华寿桃贮藏期和货架期SDH活性的影响
Fig.6 Effects of different treatments on SDH activity ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao during storage and shelf life

2.6 不同处理对中华寿桃贮藏期及货架期间CCO酶活性的影响

CCO酶是线粒体电子传递链末端氧化酶，它主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量，其在ATP合成中发挥着至关重要的作用[24,27]。不同处理对中华寿桃贮藏期间CCO活性的影响如图7-A所示，随着贮藏时间的增加，CCO活性呈先上升后下降趋势，其中对照组的CCO活性下降最明显，而经过减压结合1-MCP处理的果实在30 d的CCO活性最高，之后快速下降，但是在整个贮藏期内，CCO酶活性显著高于(P<0.05)对照组。1-MCP和减压单一处理的果实CCO酶活性没有显著差异(P>0.05)。在货架期间，4种处理果实的CCO酶活性总体呈下降的趋势(图7-B和图7-C)。整个货架期间的酶活性较低，CCO酶活性的变化比较缓慢，其中经过减压结合1-MCP处理的果实在后期的CCO酶活性显著高于(P<0.05)其他3个处理组。其中经过1-MCP处理的中华寿桃果实CCO酶活性在贮藏30 d后放入货架期6 d时有快速下降的现象(图7-C)，这可能是由于1-MCP化学性质的不稳定性造成的，但是果实放入货架后，减压结合1-MCP处理的果实CCO酶活性明显高于其他处理组。

贮藏期和货架期结果均表明，减压结合1-MCP处理能够保持较高的SDH酶和CCO酶活性。LIU等[28]研究发现，可以通过提高SDH和CCO两种酶的活性而提高采后竹笋的ATP含量和能荷水平，从而减轻竹笋在贮藏期间的褐变现象。梨果实经过ASM处理后，2种酶活性显著提高，维持了较高的能量和能荷水平，有利于提高梨果实在贮藏过程中的抗冷性和抗病性[25]。WANG等[29]在桃果实采后上也有相似的研究结果。以上结果表明减压结合1-MCP处理很好的保持SDH酶和CCO酶的活性，从而维持了细胞的正常功能，减缓了ATP能量的下降，保证了果实的能量水平，延缓了果实冷害的发生。而单一的处理组和对照组在果实贮藏的后期，酶活性受到抑制，使得细胞能量不能顺利的传递，细胞的功能活动不能正常进行，因此细胞衰老速度加快[30]，从而加剧了果实的衰老，导致了褐变的发生。

A-贮藏期CCO活性；B-货架期+3 d CCO活性；C-货架期+6 d CCO活性
图7 不同处理对中华寿桃贮藏期和货架期CCO活性的影响
Fig.7 Effects of different treatments on CCO activity ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao during storage and shelf life

3 结论

1-MCP处理、减压处理和减压结合1-MCP处理能够有效地延缓冷害造成的果肉褐变现象，提高贮藏品质，其中减压结合1-MCP处理在贮藏期30 d后效果明显好于单独处理。经过减压结合1-MCP处理后的中华寿桃果实能够维持较高的ATP和ADP，显著降低AMP水平，减缓SDH酶和CCO酶活性的下降，保证了能量生成速率，为贮藏期和货架期的果实提供能量，减轻了果实的冷害，从而延长了果实的贮藏期和货架期。