铝处理对六堡茶苗抗性生理和DNA甲基化水平的影响

叶锦培　李晓丽　唐世斌　严壮洧　陈仕香　刘海梅　黄爱萍

摘要：为探讨铝胁迫时六堡茶的生理生化变化，进而为六堡茶选育栽培和产业发展提供参考，本研究以六堡茶苗为材料，在溶液pH值为4条件下，设计0（CK）、50（T1）、100（T2）、200（T3）、400 mg/L（T4）的铝浓度进行水培处理，并于30 d后测定叶片中MDA含量和CAT、SOD、POD活性，以及DNA甲基化水平。结果表明：随着铝浓度增大，六堡茶苗的MDA含量呈先升高后降低再升高的趋势，T3处理的MDA含量最低，与CK差异显著，T1处理则略高于CK，但差异不显著;CAT活性表现为先降低再升高后降低再升高趋势，T2处理的CAT活性最高，是CK的2.76倍，其它处理则与CK无显著差异;SOD活性呈先升高后降低再升高再降低趋势，与CK相比，T3处理的SOD活性升高12.69%，与对照差异显著，其它处理则与对照无显著差异;POD活性表现为先降低再升高再降低趋势，T3处理的POD活性最大，T1处理最小，均与CK差异显著;DNA甲基化水平表现为先升高后降低趋势，T3处理的5-甲基胞嘧啶含量最高。

关键词：六堡茶;铝浓度;抗性生理;DNA甲基化

中图分类号：S571.101文献标识号：A文章编号：1001-4942（2020）04-0112-05

Abstract This study was aimed to explore the physiological and biochemical changes of Liupao tea under aluminum stress， and provide references for its breeding and industry development. The seedings of Liupao tea were used as meterials， and the aluminum concentrations of 0 （CK）， 50 mg/L （T1）， 100 mg/L （T2）， 200 mg/L （T3） and 400 mg/L （T4） were designed for hydroponics treatment at pH value of 4. The MDA content， the activities of CAT， SOD and POD and the DNA methylation level in leaves were determined after hydroponics for 30 days. The results showed that with the increase of aluminum concentration， the MDA content of Liupao tea seedlings increased first， then decreased， and increased again. Under T3 treatment， the MDA content was the lowest and significantly different from that of CK. The MDA content of T1 treatment was slightly higher than that of CK， and the difference was not significant. The CAT activity showed a decresing-increasing-decreasing-increasing trend with the increase of aluminum concentration. The CAT activity of T2 treatment was the highest as 2.76 times that of CK， while the other treatments had no significant difference with CK. The change of SOD activity showed a increasing-decreasing-increasing-decreasing trend. The SOD activity was the highest under T3 treatment， which increased by 12.69% and was significantly higher than that of CK. There was no significant difference between the other treatments and CK. The POD activity changed as decreasing-increasing-decreasing. The POD activity was the highest under T3 treatment and the lowest under T1 treatment， which were both significantly different from that of CK. The DNA methylation level firstly increased and then decreased， and the content of 5-methylcystein was the highest under T3 treatment.

Keywords Liupao Tea; Aluminum concentration; Resistance physiology; DNA Methylation

鋁（Al）是地壳中含量最丰富的金属元素，自然界中分布广泛。地壳中铝主要以氧化铝或难溶的硅酸盐等形式存在，对植物无害，但在酸性条件下（pH<5），一些固定态铝会被活化为可溶性铝（主要为Al3+）而进入土壤，对多数植物产生毒害。

茶树是一类富铝植物，铝含量明显高于其它植物[1，2]，其叶片中铝含量最高，根中次之，茎中最低[3]。六堡茶为全国二十四名茶之一。近年来，伴随黑茶消费热潮的形成，六堡茶的年产量和出口量均出现快速增长。六堡茶原产地广西壮族自治区梧州市苍梧县，土壤类型以赤红壤为主，呈酸性，交换性铝占绝对优势。但被活化的可溶性铝如何影响六堡茶的生长和品质尚不清楚。因此探讨六堡茶的铝抗性以及铝胁迫时的生理生化变化，对于其选育和栽培乃至产业的发展有重要意义。本研究在不同铝环境下对六堡茶苗进行水培，分析茶苗的抗氧化酶活性和DNA甲基化水平差异，以期了解该茶的抗铝机理，并为其耐铝种质资源的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材选自广西壮族自治区苍梧县国有天洪岭林场六堡茶六堡群体种（苍梧县六堡镇的茶树群体种）扦插苗，茶苗长势大体一致（苗高约30 cm）。

1.2 试验处理

将茶苗根系土壤洗净，移入盛有1 L 1/2Hoagland营养液水桶中水培，茶苗适应期间每周更换营养液。30 d后对茶苗进行铝胁迫，具体步骤为：将不同量的Al2（SO4）3加至1/2Hoagland营养液中，分别使铝处理浓度达到0（CK）、50（T1）、100（T2）、200 mg/L（T3）和400 mg/L（T4），溶液pH值调整为4。每处理重复3次，每重复11株茶苗。每周更换一次营养液，营养液用量为1 L。处理30 d后采集枝条顶部2～3片新生嫩叶和芽，4℃保存备用。

1.3 茶苗叶片抗性生理指标测定

丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行提取。MDA含量测定采用TBA法，CAT、POD活性测定采用可见光法，SOD活性测定采用羟胺法。

1.4 茶苗叶片DNA甲基化水平测定

1.4.1 DNA待测液的制备 采用新型植物基因组DNA试剂盒（康为世纪生物科技有限公司产品）提取茶苗叶片DNA，保存于-20℃备用。取DNA提取待测液10 μL，利用紫外分光光度计测定A260和A280，以A260估算DNA产率，A260/A280判断样品DNA纯度。

1.4.2 5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶含量标准曲线的制作 参照黑淑梅[4]的方法测定5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶含量。将50 mg胞嘧啶标准品溶解于500 μL的TE缓冲液中，再取0.75 μL上述溶液于1.5 mL TE缓冲液中混匀，即得浓度为50 μg/μL的胞嘧啶标准品溶液。5-甲基胞嘧啶标准品溶液也以相同方式制备。试验用色谱柱为Hypersil BDS-C18键合柱（5 μm，150×46 mmI.D.）;流动相组分包括5%甲醇、4.75 mmol/L己烷磺酸钠和0.2%三乙醇胺，流动相用娃哈哈纯净水配制，再用磷酸调至pH值为5.5;流速：0.7 mL/min;检测波长：273 nm;进样量：10 μL;运行时间：15 min。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶標准品进样量分别为2、4、6、8 μL和10 μL，对应浓度分别为10、20、30、40 μg/μL和50 μg/μL。

1.4.3 5-甲基胞嘧啶含量的测定 配制2 mol/L HCl溶液和4 mol/L NaOH溶液各1 L;取20 μL DNA于1.5 mL离心管中，加入20 μL 2 mol/L HCl，恒温水浴锅中80℃水解120 min;离心管中加入4 mol/L NaOH 20 μL以中和多余HCl，4 000 r/min离心1 min;吸取上清液于新离心管中待测。

叶片DNA的胞嘧啶（C）和5-甲基胞嘧啶（5-MeC）的含量使用外标准法计算。先比较样品和标准品的峰面积，再根据公式[5-MeC/（C+5-MeC）]×100%计算5-MeC的百分含量。

1.5 数据分析

利用Microsoft Excel 2007软件进行数据统计，SPSS 19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 铝对六堡茶苗抗性生理的影响

2.1.1 MDA含量 由图1可以看出，随铝浓度增大，叶片MDA含量呈现先升高后降低再升高的趋势。与CK相比，T2、T3和T4处理的MDA含量分别下降21.29%、66.91%和23.75%，差异显著（P<0.05），T1处理则升高5.36%，差异不显著（P>0.05）。

柱上不同小写字母表示0.05水平差异显著，下同。

2.1.2 CAT活性 由图2可以看出，随铝浓度增大，叶片CAT活性表现为先降低再升高再降低再升高。T2处理的CAT活性最高，是CK的2.76倍，差异显著;T4处理比CK升高12.89%，差异不显著;而T1、T3处理均低于CK，且T1与CK差异达显著水平。

2.1.3 SOD活性 由图3可以看出，随铝浓度增大，叶片SOD活性表现为先升高后降低再升高再降低。与CK相比，T1和T3处理的SOD活性分别上升7.61%和12.69%，其中T3与CK差异达显著水平;T2和T4处理的SOD活性则分别降低2.03%和7.11%，差异均不显著。

2.1.4 POD活性 由图4可以看出，随铝浓度增大，叶片POD活性呈现先降低再升高再降低的趋势。与CK相比，T3和T4处理的POD活性分别升高83.33%和33.33%，差异显著，而T1和T2处理则分别降低61.11%和50.00%。

2.2 铝对六堡茶苗DNA 5-甲基化的影响

本研究以浓度（μg/μL）为横坐标，峰面积（×10000）为纵坐标分别绘制标准品胞嘧啶和标准品5-甲基胞嘧啶的标准曲线，可得，胞嘧啶的线性方程：y=12590x+3212，R2=0.9996（图5）;5-甲基胞嘧啶线性方程：y=37715x-16156，R2=0.9996（图6）;胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶均在0～50 μg/μL范围内具有良好的线性关系，可用于后续胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶含量的计算。

由图7可以看出，六堡茶叶片5-甲基胞嘧啶含量随铝浓度的升高表现为先升高后降低，具体表现为0～200 mg/L铝浓度范围内，5-甲基胞嘧啶含量逐渐上升，并于200 mg/L时达到最高值26.92%，之后略有降低。与CK相比，T1、T2、T3和T4处理的叶片5-甲基胞嘧啶含量分别提高56.84%、110.95%、175.10%和153.27%，差异显著。

3 讨论与结论

3.1 铝胁迫对六堡茶苗抗性生理的影响

阮建云等[5]通过对茶园土与自然土的pH值和交换性铝、镁、钙含量进行对比发现，茶园土的pH值明显低于自然土，土壤交换铝含量明显高于自然土，说明种茶会使土壤酸化，而低pH值有利于交换性铝在茶园土壤中积累。适量的铝可以促进茶树生长，且有利于提高茶叶的化学品质成分。罗亮等[6]认为铝浓度大于50 mg/L会对茶树生长产生毒害作用，但不同品种对铝的反应存在差异。

植物生长过程中可能会遭受各种生物和非生物胁迫。当处于逆境时，植物体内的活性氧会大量积累，导致其不能正常生长，甚至死亡。但植物体内的保护酶CAT、SOD、POD等可以清除过量的活性氧，在植物抗逆性方面发挥重要作用。本研究中，与对照相比，50 mg/L铝处理的叶片SOD活性升高7.61%，POD和CAT活性分别降低61.11%、52.89%，MDA含量升高5.36%;100 mg/L铝处理的叶片SOD和POD活性分别降低2.03%、50.00%，CAT活性升高276.44%，MDA含量降低21.29%;200 mg/L铝处理的叶片SOD和POD活性分别升高12.69%、83.33%，CAT活性降低34.67%，MDA含量降低66.91%;400 mg/L铝处理的叶片SOD活性降低7.11%，而POD和CAT活性分别升高33.33%、12.89%，MDA含量降低23.75%。因此，除200 mg/L铝处理外，其它处理对六堡茶叶片SOD活性的促进作用不大;100 mg/L铝处理对CAT活性、

200 mg/L对POD活性的促进作用明显，并与其它处理间存在明显差异，因而六堡茶叶片SOD对铝胁迫的反应程度弱于POD和CAT，推测POD可能是消除铝胁迫产生的过量活性氧的主要酶，而CAT的清除作用稍弱于POD。

本研究中，试验所设4个铝处理浓度均对六堡茶苗的抗性生理有不同程度的影响，但与罗亮[6]、王敏[7]等对雁荡毛峰、知仁早茶、龙井43茶籽苗等茶叶品种的研究结果相比，规律性稍差。为此，课题组从整个试验进程进行必要追溯，认为试验操作、测定重复及精度满足规定要求，猜测可能是由于六堡茶六堡群体种特性不同于其它茶树品种所致或是由其它原因造成，需待进一步研究求证。

3.2 铝胁迫对六堡茶苗DNA甲基化水平的影響

DNA甲基化是植物生长发育中普遍存在的一种现象。甲基化修饰在植物基因表达、防御以及生长发育中起调节作用，可以影响植物开花、花及叶的形态等。黑淑梅[4]研究表明，Cr6+可导致小麦体内的活性氧浓度升高，高浓度活性氧条件下甲基自由基产生量升高，甲基自由基会与DNA中的胞嘧啶形成5-甲基胞嘧啶，从而提高DNA甲基化水平。王子成[8]、Kimatu[9]等认为植物体内甲基化的建立和维持需要染色体DNA甲基转移酶等参与，而DNA甲基转移酶的活性受细胞内金属离子浓度的影响，金属离子浓度过高，DNA甲基转移酶的活性会受到抑制，从而造成DNA中胞嘧啶合成5-甲基胞嘧啶的速率下降。本研究中，铝胁迫下的六堡茶苗叶片5-甲基胞嘧啶含量均高于对照，并在200 mg/L时达到最高，400 mg/L时略有下降。这可能是铝胁迫导致六堡茶体内活性氧浓度升高，甲基自由基产生加快，从而促进DNA中5-甲基胞嘧啶的合成，进而提高DNA甲基化水平，但过高的铝浓度抑制5-甲基胞嘧啶甲基转移酶的活性，并且该抑制过程不可逆，因而出现一定程度的下降。

综上所述，铝胁迫不仅能够改变六堡茶苗叶片保护酶活性，还能造成叶片DNA的损伤，引起甲基化水平改变。本研究结果可为六堡茶种质资源选择和了解其抗铝胁迫机理提供参考。

参 考 文 献：

[1] 王登良，张均伟，龙志荣，等. 六堡茶加工工艺探讨[J]. 广东茶业，2009（6）：36-38.

[2] 左小博，苏小琴，孔俊豪，等. 六堡黑茶浸提工艺优化及固体饮料开发[J]. 食品工业科技，2018，39（11）：177-182.

[3] 曹中环，邱瑞瑾，王登良，等. 六堡茶加工过程中主要生化成分的变化[J]. 广东茶业，2016（3）：26-28.

[4] 黑淑梅. 重金属铬对小麦根系DNA甲基化水平的影响[J]. 吉林农业科学，2012，37（2）：14-15，26.

[5] 阮建云，王国庆，石元值，等. 茶园土壤铝动态及茶树铝吸收特性[J]. 茶叶科学，2003，23（增）：16-20.

[6] 罗亮，谢忠雷，刘鹏，等. 茶树对铝毒生理响应的研究[J]. 农业环境科学学报，2006，25（2）：305-308.

[7] 王敏. 茶树对铝的生理响应与固定累积研究[D]. 北京：中国农业科学院，2017.

[8] 王子成，马洪霞，何艳霞. 重金属镉对拟南芥DNA甲基化的影响[J]. 植物生理学通讯，2009，45（2）：115-118.

[9] Kimatu J N. 铝胁迫诱导玉米DNA甲基化变异及其与铝毒性耐性基因型间差异的可能关系研究[D]. 长春：东北师范大学，2010.