龙须菜细胞壁多糖对硼的吸附性能研究

龚芳芳 王 晔 陈淑敏 张玉琦 刘英丹 孟天宇 娄永江 李勇勇

(宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315832)

龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是我国重要的海洋经济藻类之一，因其营养丰富，美味且富含膳食纤维等特点而备受人们的喜爱[1]。 硼的本底值是龙须菜安全监控的重要指标之一，据报道，近年来，我国龙须菜中硼的本底值已呈现逐年升高的趋势[2]。 硼是海洋中浮游植物等生物生长所必需的微量元素，而且海洋藻类是已知富集硼的有机体，每年平均有4.4×1010kg 硼被海洋有机体摄取[3]。 硼在参与细胞壁的构建时，首先经过植物的细胞壁进入细胞质内并被植物吸收利用[4]。 因此，细胞壁作为植物抵御外界污染物以及重金属毒害的第一道屏障发挥着关键作用[5]。Matoh 等[6]研究发现，高于80%的硼与烟草愈伤细胞壁中的果胶多糖结合。 杨玉华等[7]研究认为油菜体内硼的结合位点主要集中于细胞壁。

植物细胞壁由糖、蛋白质等物质构成，其中多糖组分在初生细胞壁中占主导地位[8]。 龙须菜细胞壁主要由纤维素、半纤维素、海藻胶(琼胶)、蛋白质等成分组成[9]。 细胞壁多糖中富含的各种负电基团(羟基、羧基、氨基等)可通过化学、物理等吸附方式将金属阳离子固着于细胞壁上，进而在一定程度上避免了游离重金属对细胞壁内敏感细胞的干扰和毒害[10-11]。 可见，多糖类物质在维持细胞壁功能方面不可或缺。 研究发现，硼胁迫后，植物细胞壁组分如半纤维素、果胶等含量明显上升[12]，其对硼的富集能力也随之显著增强。 而细胞壁结合二价阳离子的能力与多糖含量及所富含官能团如羧基、羟基和巯基的数量呈正相关[13]。目前关于龙须菜中硼的研究仍处于探究硼分布的初步阶段，研究表明龙须菜吸附的硼多集中在细胞壁。 而关于龙须菜细胞壁多糖组分，如海藻胶(琼胶)、纤维素、半纤维素在其对硼的吸附固定过程中所起到的作用，以及各细胞壁多糖组分中哪些官能团在硼吸附固定过程中起到关键性作用等一系列问题尚未解决。 因此，本试验以褐藻龙须菜为研究对象，通过吸附动力学试验和傅立叶红外光谱(fourier transform infrared，FTIR)技术材料表征，探究龙须菜吸附硼的行为特征，揭示龙须菜细胞壁组分吸收累积硼的内在机理，以期为藻类对硼毒害的适应性及耐性分子机制的研究提供新的思路和研究方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

龙须菜采自福建省福州市马尾区。 选取高度在15～25 cm 之间，长势均一的鲜样龙须菜，经超纯水迅速冲洗后，备用。

液氮购自宁波海曙东赢气体有限公司；乙醇、丙酮、甲醇、氯仿、苯酚、KOH、乙二胺四乙酸二钠、氯化钙、硫酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；硼酸溶液、α-淀粉酶，购自宁波甬川生物科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

HX-10-50DG 台式压盖多歧管冷冻干燥机，上海沪析实业有限公司；FK-DG300 电感耦合等离子发射光谱，美国PE 公司；H-2050R 离心机，湖南湘仪离心机有限公司；FTIR-4600 傅立叶变换红外光谱仪，中世沃克科技发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞壁的提取及硼含量的测定 参照Zhong等[14]的方法并做适当修改，通过细胞破碎的方式抽提细胞壁。 新鲜龙须菜吸取适量水分后倒入研钵中，研磨过程中加入液氮直至龙须菜呈粉末状，然后转移至50 mL 离心管中，加入75%冰乙醇浸提20 min，5 000 r·min-1离心10 min，去上清液后，采用冰丙酮溶液浸提30 min，再离心10 min 去上清。 按同样操作步骤，再依次加入甲醇∶氯仿(体积比为1 ∶1)、甲醇提取。 去上清液后，将沉淀用30 mL 乙酸/苯酚/水的溶液(体积比为1 ∶2 ∶1)超声辅助浸提30 min(25℃、200 W)，5 000 r·min-1离心10 min，以去除蛋白质、酚类等物质，反复洗提3 次(浸提试剂用量均为10 mL·g-1，以样品鲜重计)。 再用α-淀粉酶去除淀粉多糖后(37℃、3 h)，用20 mL 超纯水冲洗残留在细胞表面杂物，重复3 次，所得沉淀即为细胞壁多糖粗品，冷冻干燥后密封保存(4℃)，标记为GW-A。

细胞壁经0.02 mol·L-1乙二胺四乙酸二钠解析40 min，解析3 次，去除样品中本底硼，样品标记为GWA1。 GW-A1外源硼胁迫后标记为GW-A2。 准确称取GW-A、GW-A1和GW-A2样品于消解罐中，同时加5 mL 浓硝酸进行消解。 待消解完成后，用超纯水定容至25 mL，再经0.22 μm 滤膜过滤，采用电感耦合等离子光谱法(inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy，ICP-AES)测定各样品组分的硼含量。

1.3.2 细胞壁多糖组分的分离 参照朱琳等[15]的方法并做适当修改。 称取2 g 干燥的细胞壁(GW-A)样品，加入160 mL 超纯水，沸水浴2 h，然后5 000 r·min-1离心10 min，重复操作3 次，上清液为琼胶提取组分，冷冻干燥后称重备用；沉淀用去超纯水重复冲洗3 次，冷冻干燥后，4℃保存得去琼胶样品GW-B。样品GW-B 脱硼步骤参照1.3.1，硼脱除后样品标记为GW-B1。 GW-B1外源硼胁迫后标为GW-B2。 各组分硼测定方法同1.3.1。

结合Hoson 等[16]的方法，取样品GW-B 粉末置于离心管中，加入20 mL KOH 溶液(4 mol·L-1)浸提6 h，浸提3 次，上清液为半纤维素。 沉淀经离心分离后采用超纯水快速淋洗3 次，冷冻干燥后，称重，4℃保存备用，标记为GW-C。 样品GW-C 脱硼步骤参照1.3.1，硼脱除后标记为GW-C1。 GW-C1外源硼胁迫后标为GW-C2。 各组分硼测定方法同1.3.1。

1.3.3 细胞壁多糖组分的测定 参照Dubios[17]的方法，苯酚硫酸比色法以葡萄糖溶液作为标准溶液。 采用苯二酚比色法测定细胞壁糖醛酸[18]。

1.4 龙须菜细胞壁硼吸附的动力学试验

吸附溶液为5 mg·L-1的 H3BO3溶液，0.02 mol·L-1CaCl2溶液作为支持电解液(pH 值5.75)。 将0.02 g 龙须菜细胞壁各组分(GW-A、GW-B、GW-C)置于底部垫有滤纸的一次性注射器中，注射器上方装置有滴定管(100 mL)用于盛放吸附溶液，其针头部位接连一次性输液器(流速2 mL·min-1)用于控制流速。用离心管收集流出液后采用ICP-OES 测定流出液中硼离子的浓度，当流出液中硼离子浓度与吸附溶液中硼离子浓度相同时，吸附即达到饱和。 试验重复4 次，取平均值做吸附曲线。

1.5 不同处理细胞壁表面官能团表征

将光谱纯溴化钾与样品混匀压片，按1 ∶120 的比例加入，于研钵中充分研磨。 同等条件下测定不同处理细胞壁样品在4 000～500 cm-1波数内的FTIR 图。

1.6 数据处理

试验采用Excel 2013 和Origin 9.0 进行数据预处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 细胞壁多糖组分及硼含量的测定结果

龙须菜细胞壁中多糖组分主要由琼胶、半纤维素、纤维素3 种成分组成。 由表1 可知，细胞壁中纤维素含量较高，约为40.27%，其次为琼胶(35.21%)、半纤维素(24.49%)。 硼多与琼胶结合，测得琼胶中硼含量为51.25 mg·kg-1，纤维素、半纤维素中硼含量分别为27.55、20.80 mg·kg-1。 硼脱除试验中，细胞壁(GWA)、细胞壁去琼胶(GW-B)和细胞壁去琼胶去半纤维素(GW-C)3 个组分的硼脱除率高达97.61%，这为进一步探究硼与细胞壁多糖组分各官能团的交互作用奠定了基础。

表1 细胞壁多糖含量和硼本底值Table 1 Cell wall polysaccharide content and boron background value

2.2 细胞壁多糖对硼的吸附试验结果

由图1 可知，龙须菜细胞壁总吸附量约100 mg·kg-1，细胞壁各组分在前100 min 内，吸附速率呈现快速增长的趋势，随后吸附速率明显减慢，在350 min 后达到平衡。 吸附平衡后，去琼胶后即GW-B 比GW-A 硼吸附量相对降低了50.13%，可知琼胶的吸附量为50.13%。 去半纤维素后即GW-C 比GW-B 硼吸附量相对降低21.20%，可知半纤维素的吸附量为21.20%。 而28.67%的硼吸附在纤维素上。 结果表明细胞壁及多糖组分在吸附过程中硼吸附量与其本底硼含量相差甚少，说明各组分的官能团充分暴露，吸附达到饱和。

图1 龙须菜细胞壁不同组分对硼的吸附曲线Fig.1 Adsorption curve of boron for different components of Gracilaria lemaneiformis cell wall

2.3 不同细胞壁组分的红外光谱分析

参照文献[19]对龙须菜细胞壁各组分(GW-A、GW-B、GW-C)的红外光谱图(图2)进行解析，得到细胞壁多糖组分主要官能团变化的信息(表2)。

通过对龙须菜细胞壁的红外光谱(图2)进行解析，得到对照组即龙须菜细胞壁的特征峰，在3 431 cm-1处为氨基(-NH)、羟基(-OH)伸缩振动重合峰(NO.1)；2 928 cm-1处的峰可能是甲基(-CH3)的对称伸缩振动峰(NO.2)；1 643 cm-1和1 512 cm-1处的2 个强吸收峰对应酰胺Ⅰ带(NO.3)和酰胺Ⅱ带(NO.4)，源于细胞壁中残留的蛋白质对谱峰(NO.5)的贡献，推测含有少量蛋白质与琼胶或纤维素形成糖蛋白复合物。 1 258 cm-1处的吸收峰(NO.6)可能是羧基的CO、硫酸酯的C-O-S 或磷酸盐的特征吸收峰；1 057 cm-1处的吸收峰归属为纤维素多糖链中的C-C 伸缩振动(NO.7)。

图2 细胞壁改性前后红外光谱表征Fig.2 Infrared spectroscopy characterization before and after cell wall modification

采用傅里叶红外光谱对龙须菜细胞壁及各组分进行半定量分析，每个谱图分别以2 928 cm-1处-CH3中C-H 特征吸收峰的吸光度(A2928)为标准值，利用其他特征峰处的吸光度A 与A2928的比值变化间接半定量分析官能团含量的差异[20]，分析结果如表2 所示。 根据A/A2928比值得出，在龙须菜GW-A 组分中，羟基和氨基官能团数目较多，羧基、纤维素多糖链CC 次之。 与GW-A 相比，GW-B、GW-C 的A3431/A2928和A1258/A2928比值依次递减，表明龙须菜细胞壁多糖组分即琼胶、半纤维素、纤维素均被一定量的羟基、羧基基团覆盖。 其中，羟基大量分布在纤维素中，而在琼胶、半纤维素2 个组分中含量相当；半纤维素中羧基含量较多。

表2 龙须菜细胞壁不同多糖组分及相应官能团Table 2 Different polysaccharide components and corresponding functional groups in the cell wall of Gracilaria lemaneiformis

2.4 硼胁迫前后细胞壁各组分的红外光谱分析

龙须菜细胞壁组分固定硼时，官能团特征吸收峰位移发生偏移则说明其参与了硼的吸附；反之则不吸附或吸附能力弱。 因此，可以通过吸收峰位移变化的程度来判断参与硼结合的官能团。 前人也得到类似的研究成果，如周冉[21]研究表明番茄细胞壁果胶在累积Cd2+过程中，官能团吸收峰位移偏离程度代表着对Cd2+的吸附能力；韩润平等[22]比较了谷壳在Pb2+胁迫前后羟基特征峰变化，结果表明羟基基团上的氢因被Pb2+取代而向高频移动。

图3 细胞壁脱硼及硼胁迫后红外光谱图比较Fig.3 Comparison of infrared spectra after deboration and boron stress of cell wall

图4 细胞壁去琼胶脱硼及硼胁迫后的红外光谱图比较Fig.4 Comparison of infrared spectra of dephosphorization and boron stress in cell wall degumming agar

细胞壁及各组分对照组和硼胁迫组红外谱图如图3～5 和表3 所示。 硼胁迫组GW-A2的羟基伸缩振动峰与对照组GW-A1相比向高频位移动了15 cm-1，GW-B2、GW-C2向高频分别移动了9、2 cm-1。 硼胁迫组GW-A2和GW-B2羧基伸缩振动峰向高频移动了10、3 cm-1，而GW-C2向低频移动1 cm-1。 羟基、羧基吸收峰迁移位移的缩减表明随着琼胶、半纤维素的去除，其吸附作用相应减弱。 GW-A2、GW-B2、GW-C2羧酸盐COO-分别向高频方向移动了13、25、20 cm-1，表明随着琼胶及半纤维的去除，羧酸盐COO-的不对称伸缩振动作用逐渐凸显。 多糖链C-C 在硼胁迫后，其作用也明显增强，其中，GW-B2向低频移动了5 cm-1，GW-C2向高频移动13 cm-1，说明多糖链C-C 在细胞壁去琼胶去半纤维后，成为纤维素中与硼结合的主要位点之一。 蛋白质特征峰酰胺Ⅰ带(-C-N)和酰胺Ⅱ带(-N-N)未表现出对硼的吸收，可忽略不计，即细胞壁蛋白质组分的硼本底值低于ICP-OES 最小检出限。 综上所述，琼胶、半纤维素中的羟基、羧基是硼的主要结合位点，而纤维素中起主要官能团作用的是多糖链C-C 和羧酸盐COO-。

表3 龙须菜细胞壁多糖硼胁迫前后前后FTIR 光谱表征Table 3 FTIR spectroscopic characterization of different polysaccharide components in the cell wall of gracilaria lemaneiformis

图5 细胞壁去琼胶去半纤维素脱硼及硼胁迫红外光谱图比较Fig.5 Comparison of infrared spectrum of decellularization and boron stress of cell wall degummed agarose

3 讨论

对龙须菜细胞壁各个多糖组分红外光谱谱图进行半定量分析，结果发现龙须菜细胞壁中含量最高的为羟基、氨基，其次为多糖链C-C、羧基。 对比各多糖组分所含的官能团差异，羟基大量存在于纤维素中，羧基在琼胶中含量较多。 半纤维素中多糖链C-C 含量最高。 多糖的3 个组分中均含有一定量的羟基、氨基、羧基。 由此可见，琼胶、半纤维素和纤维素均有吸附硼的潜力。

龙须菜细胞壁多糖组分主要由琼胶、半纤维素、纤维素3 种成分组成。 海洋藻类龙须菜作为琼胶的提取原料，其细胞壁的琼胶含量约35%。 硼的吸附动力学试验结果表明，硼(50.13%)主要与细胞壁中的琼胶组分结合，其次是纤维素及半纤维素。 研究发现在油菜体内，细胞壁是硼的主要结合位点，尤其是细胞壁中的果胶成分[23]。 同时，Zheng 等[24]也发现细胞壁中的果胶可以与阳离子共价结合。 目前，相关陆生植物中果胶与硼离子结合机制的研究较多，藻类植物中富含大量的海藻胶(琼胶)，其对硼的吸附机制与果胶类似。研究表明，细胞壁结合金属离子的能力与官能团羧基、羟基和巯基的多糖数量呈正相关[13]。 比较硼吸附前后GW-A1、GW-A2红外光谱图可知，琼胶多糖的羧基、羟基官能团对硼具有一定吸附能力。 这可能是因为琼胶中的琼胶酯含有较多负电基团，负电荷的多糖单元靠静电引力与金属离子相结合，如羟基、羧基、醛基、氨基等能结合多种阳离子[25-26]。 琼胶虽为中性糖，但其内含的糖醛酸、藻酸盐等成分可以溶解、络和金属离子[27-28]。 其中藻酸盐主要由2 种酸性单糖1，4-β-D-甘露糖醛酸(mannuronic acid，MA)及α-L 古罗糖醛酸(guluronicacid，GA)无序排列的线性缩合高聚物组成，它们分别提供单基配位和多基配位体[27，29]。 然而，不同植物中胞外多糖组成不同，与硼的结合机制也存在一定的差异。 由此推测琼胶中的半乳吡喃糖也是结合硼离子的主要成分之一。 有研究表明，半纤维素中的阿拉伯木聚糖链上富含的葡萄糖残基结构使其带一定的负电荷[30]，易与阳离子结合。 同时半纤维素还包括了较多高分子多糖，如多缩阿拉伯糖、多缩甘露糖和多缩半乳糖醛酸等[31]。 在硼胁迫下，这些高分子多糖富含的羟基和羧基等官能团可以与硼离子迅速结合。 此外，琼胶中富含各种多糖聚合物[32-33]，很可能与半纤维争夺硼的结合位点。 随着琼胶的去除，半纤维素上的官能团充分暴露，使得半纤维可以结合更多的硼。进而推测细胞壁中硼主要通过静电、离子络合等化学吸附作用与琼胶以及半纤维素结合。

由吸附硼前后的GW-C1和GW-C2的红外光谱图可知，纤维素虽然富含羟基、羧基等有机基团，但这些官能团对硼离子的红外吸收峰迁移并不明显。 而GW-C(纤维素)吸附硼的过程中纤维素多糖链C-C、羧酸盐COO-不对称振动的红外吸收峰向高频迁移位移较大。 究其原因，可能是因为纤维素是一种由D-葡萄糖残基通过β-1，4-糖苷键连接而成的直链多糖[5]，多糖结构上的大量羟基基团极可能将分子链间和分子内部的氢键包裹，即掩盖了纤维素的活化吸附作用[34]。 另一方面也可能是因为纤维素自身的还原性使得多糖链C-C 断裂生成二醛和酸，可与一定量的硼螯合[35]。 纤维素因表面积大和含有大量的微孔结构，使其对金属离子具有良好的吸附性能[36]，而其吸附Cu2+、Pb2+、Cd2+等金属阳离子的过程是由颗粒扩散和化学反应共同控制[32]。 因此，硼不仅可以通过络合作用，而且可通过范德华力和静电引力等物理吸附作用与纤维素紧密结合在一起。

4 结论

综上所述，龙须菜细胞壁及多糖组分对硼具有较高吸附力，其与硼的结合方式主要是以离子络合及物理吸附为主。 其中琼胶、半纤维素主要以化学吸附为主，纤维素中物理和化学吸附两者并存。 龙须菜细胞壁吸附动力学结果表明，各组分在350 min 基本达到吸附饱和，饱和吸附量为100 mg·kg-1。 硼主要与琼胶、半纤维素中的羟基、羧基，纤维素的多糖链C-C 相互作用。 各多糖组分吸附量分别为:琼胶(50.13%)、纤维素(28.67%)、半纤维素(21.20%)。 本研究为进一步探究藻类细胞壁多糖成分与硼结合机制的研究提供了新的思路和方法。