依达拉奉对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的干预作用

杨玲玲 石广军

慢性阻塞性肺疾病(以下简称“慢阻肺”)是以气流受限为主要病理特征并呈进行性发展的常见肺部疾病，目前对于该病的病因与发病机制尚不明确，临床普遍认为该病的发生与香烟、烟雾等有害气体或有害颗粒吸入所致的肺部异常炎症反应密切相关[1]，而在此基础上肺部的抗氧化、抗蛋白酶功能的失衡以及慢性炎症的发展是慢阻肺病情进展的主要原因[2-3]。依达拉奉是临床较为常用的强效自由基清除剂，广泛用于缺血性脑卒中后、脑组织的保护治疗，且大量研究表明依达拉奉还具有一定的抗炎作用，并在治疗多种肺损伤疾病中表现出了较好的临床效果。由于依达拉奉具有抗氧化和抗炎的作用，近年来临床在采用依达拉奉治疗慢阻肺患者中也表现出了较好的有效性和安全性，鉴于此本研究旨在通过对慢阻肺模型大鼠进行不同剂量的依达拉奉治疗，为进一步探讨依达拉奉在治疗慢阻肺中的作用机制提供依据。

资料与方法

一、实验动物

购取120只8周龄健康雄性SD大鼠，体重(200±20)g，采用随机数字表法分为空白组、慢阻肺模型组、低剂量依达拉奉组和高剂量依达拉奉组，每组各30只，雌雄各半。所有大鼠均于恒温动物房内饲养1周，排除体重不符、实验过程中伤亡的大鼠，实际纳入研究大鼠72只，每组各18只，雌雄各半。

二、方法

1 造模方法 被动吸烟造模： 采用气管内滴入脂多糖联合被动吸烟法对慢阻肺模型组、低剂量依达拉奉组和高剂量依达拉奉组大鼠进行造模，操作方法：第1d和第14d采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后进行固定，以压舌板压住舌根，以弯头灌胃针轻轻插入大鼠气管，以感觉触到气管软骨环，且观察大鼠呼吸音增粗为插入成功标准，随后缓慢注入200μg/200mL脂多糖200μL，听诊见湿罗音后将固定大鼠连同固定板竖起，轻微左右摇晃3～5次，使注入的脂多糖在左右两肺尽可能的均匀分布，完成后取下大鼠单独饲养，待意识、行为、活动完全恢复后放回原饲养笼中。

造模过程： 注射脂多糖当日不进行被动吸烟造模，第2～13d和第15～28d每日根据大鼠的昼夜节律于20：00开始将大鼠放入自制密闭有机玻璃箱中，仅侧壁留置直径约1cm通气孔，在密闭箱顶部设置点烟盒，将同一品牌香烟点燃2支后放置盒中密闭，使烟雾向下充满密闭箱，每次10min，换烟间隔5min/次，连续被动吸烟4次。空白组大鼠不造模，但于注射脂多糖同期进行麻醉和固定，并注入同体积生理盐水，在被动吸烟操作时，置入未点烟的密闭箱中。被动吸烟前空白组和慢阻肺模型组腹腔注射20mg/kg生理盐水，低剂量依达拉奉组和高剂量依达拉奉组注射配置的低浓度依达拉奉注射液和高浓度依达拉奉注射液，剂量均为20mg/kg。配置方法：采用30%丙二醇10mL进行配置，低浓度依达拉奉注射液加入依达拉奉20mg，高浓度依达拉奉注射液加入依达拉奉40mg。

2 观察指标 肺功能检测：四组大鼠于造模28d后，麻醉固定大鼠，采用无束缚全身体积描记系统(美国DATA SCIENCES INTERNATIONAL提供)对大鼠的静息呼吸频率(frequence，f)、潮气量(tidal volume，VT)、吸气峰流速(Peak inhale flow，PIF)、气道阻力(Airway resistance，RI)以及动态肺顺应性(Dynamic lung compliance，Cdyn)水平进行检测。

血清抗氧化因子：造模28d后于肺功能检测完成后摘取大鼠眼球取血，分别采用硫代巴比妥法和黄嘌呤氧化酶法对血浆丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)进行检测。

支气管肺泡灌洗液炎性因子：取血后固定大鼠，暴露双侧肺叶，结扎肺支气管，采用针头气管插管缓慢注入3mL生理盐水，10s后回抽，重复操作3次作为支气管肺泡灌洗液标本，采用染色法检测白细胞(White blood cell，WBC)水平，采用酶联免疫吸附法检测白介素-8(Interleukin-8，IL-8)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平。

肺组织采样及检测：完成支气管肺泡灌洗后，取右上肺和右下肺，生理盐水冲洗后浸泡于10%中性福尔马林溶液中固定，经组织脱水、石蜡包埋切片，采用HE染色观察肺组织和支气管情况，并对基质金属蛋白酶-9(Matric metalloproteinase-9，MMP-9)和基质金属蛋白酶-12(Matric metalloproteinase-12，MMP-12)表达情况、免疫组化学半胱胺酸蛋白酶蛋白(Caspase-12)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding Protein-homologous protein，CHOP)表达进行检测。

三、统计学方法

结 果

一、肺功能检测结果

肺功能检测结果列于下表。整体比较(单因素方差分析)知：各指标整体差异有统计学意义(P<0.05)。多重比较并结合主要数据分析：由(表1)可见，慢阻肺模型组与空白组相比，f、RI明显增高，Cdyn以及PIF水平均明显降低(P<0.05)，提示慢阻肺模型组造模后，存在明显的气流受限和阻塞性通气障碍，造模具有可行性。与慢阻肺模型组相比，低剂量依达拉奉组RI明显降低，Cdyn、PIF水平明显升高，高剂量依达拉奉组f、RI均明显降低，Cdyn及PIF明显升高。与低剂量依达拉奉组相比，高剂量依达拉奉组Cdyn明显升高(P<0.05)。

二、肺组织病理检测结果

空白组肺组织和肺泡结构均无明显异常(图1)，慢阻肺模型组和低剂量依达拉奉组均可见明显的支气管炎症细胞浸润，肺泡腔扩大，肺泡壁变薄(图2、图3)，高剂量依达拉奉组支气管炎症细胞浸润，肺泡腔扩大，肺泡壁变薄程度相比慢阻肺模型组和低剂量依达拉奉组明显减轻(图4)。

图1 空白组肺组织(SP，×400)图2 慢阻肺模型组肺组织(SP，×400)图3 低剂量依达拉奉组肺组织(SP，×400)图4 高剂量依达拉奉组肺组织(SP，×400)

三、其他检测指标比较

1 血浆抗氧化物 仿前做整体比较，两指标整体差异均有统计学意义(P<0.05)。多重比较并结合主要数据分析：与空白组相比，慢阻肺模型组MDA、SOD水平明显升高(P<0.05)；与慢阻肺模型组相比，低剂量依达拉奉组和高剂量依达拉奉组MDA明显降低(P<0.05)，SOD水平无明显变化(P>0.05)；低剂量依达拉奉组与高剂量依达拉奉组相比，MDA、SOD水平差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

2 支气管肺泡灌洗液检测及结果 仍仿前做整体比较，三指标整体差异均有统计学意义(P<0.05)。多重比较并结合主要数据分析：与空白组相比，慢阻肺模型组WBC、TNF-α水平明显升高(P<0.05)，IL-8水平无明显变化(P>0.05)；与慢阻肺模型组相比，低剂量依达拉奉组和高剂量依达拉奉组WBC、TNF-α水平均明显降低(P<0.05)，IL-8水平无明显变化(P>0.05)；与低剂量依达拉奉组相比，高剂量依达拉奉组WBC、TNF-α水平明显降低(P<0.05)(见表2)。

3 肺组织检测结果 仍仿前做整体比较，四指标整体差异均有统计学意义(P<0.05)。多重比较并结合主要数据分析：与空白组相比，慢阻肺模型组MMP-9、MMP-12、Caspase-12、CHOP表达明显增强(P<0.05)；与慢阻肺模型组相比，低剂量依达拉奉组和高剂量依达拉奉组MMP-9、MMP-12、Caspase-12、CHOP表达均明显减弱(P<0.05)；与低剂量依达拉奉组相比，高剂量依达拉奉组MMP-9、MMP-12、Caspase-12、CHOP表达明显减弱(P<0.05)。

表1 肺功能检测结果

注：整体比较为单因素方差分析。多重比较为HSD-q检验，显著性标记a、b、c 分别为和A、B、C组相比P<0.05。

表2 其他检测指标比较

讨 论

一、慢阻肺造模

慢阻肺的发病机制目前临床尚不明确，普遍认为与香烟、烟雾等有害气体或有害颗粒的吸入密切相关，因而在实验慢阻肺大鼠的造模方法方面常见的主要有被动吸烟、被动吸入二氧化硫、脂多糖气道注入、弹性蛋白酶气道注入以及多种方法复合等[4-6]，相关研究表明，被动吸烟所采用的香烟具有影响慢阻肺发生的大量氧化剂和自由基，可促使炎性细胞的释放和聚集，而在此基础上被活化的炎症细胞可进一步导致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，临床可表现出肺气肿以及慢阻肺的病理过程，因而成为慢阻肺造模中最常用的方式。但由于被动吸烟在诱导慢阻肺模型通常需要3～6个月，实验周期较长，不利于控制实验动物的其他生理状态，影响最终实验结果。且有临床研究认为，单纯的吸烟并不能完全导致慢阻肺的发生，其发生率仅占慢阻肺发生总人数的20%左右。脂多糖是具有激活人体非特异性免疫的内毒素之一，通过气管滴注脂多糖可导致慢性炎症的发生，相关动物研究表明气管滴注脂多糖后的肺损伤发展和进程与慢阻肺相似，但反复多次脂多糖滴入容易造成动物死亡，因此本研究结合被动吸烟与气管滴注脂多糖两种方式，分别于造模初期和中期对实验大鼠进行气管滴注脂多糖，并在此之后持续每日进行被动吸烟，在吸烟时间的制定上为满足实验大鼠与人类昼夜节律的一致性，将被动吸烟时间安排在夜间执行。本研究结果显示，造模28d后慢阻肺造模组大鼠其肺功能检测指标、血浆抗氧化物MDA、SOD水平、支气管肺泡灌洗液WBC、TNF-α水平以及肺组织MMP-9、MMP-12、Caspase-12、CHOP表达均表现异常，且与空白组相比差异具有统计学意义，由此提示慢阻肺模型组造模后存在明显的气流受限和阻塞性通气障碍，而免疫组化Caspase-12、CHOP表达的增强也提示造模后大鼠已出现肺组织细胞的损伤和凋亡，造模具有可行性。

二、依达拉奉的作用机制

本研究结果显示，(1)在肺功能检测方面，两种剂量依达拉奉治疗大鼠相比慢阻肺模型大鼠均表现为RI明显降低，而Cdyn和PIF水平明显升高，其中高剂量依达拉奉治疗大鼠f水平也较慢阻肺模型大鼠明显降低，表明依达拉奉对于改善气流受限以及阻塞性通气障碍所导致的呼吸困难等临床症状均有显著效果[7-8]，但高剂量依达拉奉表现更加突出，提示依达拉奉的使用剂量可能与抑制慢阻肺病情进展的程度具有一定的相关性。(2)在血浆抗氧化物检测方面低剂量依达拉奉组和高剂量依达拉奉组MDA水平均明显降低，MDA作为反映氧化损伤严重程度的重要检测指标[9-10]，慢阻肺模型大鼠MDA水平的增高表明慢阻肺大鼠可能存在严重的肺氧化损伤，而通过运用依达拉奉大鼠的MDA水平得以明显降低，提示其具有减轻慢阻肺氧化损伤的作用，虽然依达拉奉大鼠SOD水平与慢阻肺模型大鼠相比其差异并无统计学意义，但具有一定的下降趋势，国外学者表示这可能与依达拉奉直接对抗氧化性物质，从而避免了过量氧化性物质对SOD基因表达的影响[11]。(3)支气管肺泡灌洗液检测方面，慢阻肺模型组WBC、TNF-α水平明显升高，而低剂量依达拉奉组和高剂量依达拉奉组WBC、TNF-α水平均明显降低。其中TNF-α是具有多种炎症介质功能的重要炎性因子，可诱导与炎症过程中包括淋巴细胞、单核细胞以及中性粒细胞等在内多种炎性细胞的粘附浸润密切相关血管粘附因子的表达，因而其水平可随着气道阻塞的严重程度而逐渐增高[12-14]。由此表明在炎症反应严重的情况下应用依达拉奉可以通过减少白细胞，降低TNF-α水平达到减轻慢阻肺肺内炎症损伤的作用。(4)在肺组织检测方面，相关研究表明MMP在吸烟相关的慢阻肺病情发展中具有突出作用，与气道重塑、炎症反应以及伤口愈合等多种生理过程均有密切的关系，临床慢阻肺、哮喘、肺间质纤维化以及肿瘤等疾病的病理过程中均可见MMP的过度表达。其中MMP-9主要由中性粒细胞和巨噬细胞合成并以酶原形式分泌，研究表明MMP-9是参与炎症反应的重要基质金属蛋白酶，且其活性与气流受限程度呈相关性[15]。而MMP-12是巨噬细胞产生，受香烟烟雾影响较大，其分解的弹性蛋白可产生对单核细胞具有趋化性的组织碎片，而这种同时存在的正反馈循环可导致肺组织的持续损伤，因此可作为评价炎症反应的标志物[16]。本研究结果显示，慢阻肺模型大鼠MMP-9和MMP-12均表现为高表达水平，而应用依达拉奉后MMP-9和MMP-12表达明显减弱，且高剂量依达拉奉表现更加具有优势。这与江兴等人研究结果[17]较为一致，并且认为依达拉奉具有抑制MMP-9和MMP-12表达的作用，且对于平衡蛋白酶/抗蛋白酶系统具有一定的效果，从而达到抗肺气肿、肺损伤的作用。在免疫组化检测方面，Caspase-12、CHOP作为内质网应激反应中的重要因子，与肺组织细胞凋亡有密切的关系[18-19]。在经依达拉奉治疗后大鼠Caspase-12、CHOP表达相比造模后有明显的降低，且高剂量依达拉奉组相比低剂量依达拉奉更加突出，由此推测依达拉奉的治疗效果可能与内质网应激反应有关。井忠喜[20]和李瑜等[21]人研究结果均证实依达拉奉可通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，降低机体白三烯的生成，达到有效抑制并清除大脑内毒性羟自由基和减轻细胞磷脂膜氧化损伤的作用，进而有效改善慢性阻塞性肺疾病急性加重患者肺功能及氧化应激反应。

结 论

依达拉奉可提高抗氧化能力、减少炎症因子的释放和聚集以及改善蛋白酶调节，对延缓慢阻肺临床病理进展有一定的作用。