非小细胞肺癌肿瘤微环境中免疫细胞特征及临床意义

王新乐 袁飞 吴显宁 徐美青

肺癌是目前全球范围内因癌症相关死亡的主要原因。患者五年生存率约为18%，晚期患者的生存率仅为3.9%，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌的85%[1]。随着各国学者们对肿瘤免疫微环境的不停探索，免疫治疗已经成为了非小细胞肺癌患者除手术、化疗、放疗及靶向治疗之外的另一主流选择，免疫治疗使得治愈晚期肿瘤成为可能，甚至在逐步改变着局部晚期和早期可切除恶性肿瘤的临床实践[2-4]。机体免疫内环境的稳定对于维持免疫耐受、抑制自身免疫反应及防止免疫细胞过度增殖均具有重要的作用。

本研究旨在通过检测NSCLC中各免疫细胞的表达水平,分析其在NSCLC发生发展过程中的意义及其与临床病理特征的相关性，为NSCLC的临床诊疗提供参考依据。

材料和方法

一、临床资料

收集2017年8月至2018年8月期间在中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)接受手术治疗的NSCLC(所有组织标本病理类型全部经过术后病理证实)患者69例，其中包括男49例，女20例，年龄45～82(67.25±8.78)岁。病理类型含腺癌43例，鳞癌26例；病理分期Ⅰ/Ⅱ期48例， Ⅲ/Ⅳ期21例；肿瘤大小≦3cm患者36例，>3cm患者33例；术后病理证实淋巴结转移阳性患者27例，阴性患者42例。其诊断均符合2015年WHO肺癌诊断标准。所有患者均为初次诊断并接受标准肺癌根治性手术；有完整临床资料且术前均没有接受过放疗、化疗等其他相关治疗。

取69例患者的肺癌肿瘤组织及对应的距离肿瘤远端2cm以上的癌旁组织待测。

二、仪器和试剂

Attune NxT 流式细胞仪(美国ThermoFisher公司)。肿瘤消化仪、肿瘤消化试剂盒(货号：130-095-929)均购自Milteny公司。红细胞裂解液(货号：R7757)购自Sigma公司。Fixable Viability Stain 780(死活染料，货号： 565388)、Human BD Fc Block(Fc受体阻断剂，货号：564219)、Brilliant stain buffer(流式缓冲液，货号： 563794)、Transcription Factor Buffer Set(转录因子和核蛋白试剂，货号：562574)均购自美国BD公司。

三、方法

1 标本的处理 ① 对术中采集的标本进行称重并记录数据；②根据肿瘤消化试剂盒的说明书进行操作，将标本组织消化分解为单细胞悬液；将所得单细胞悬液用70 μm滤网过滤后洗涤，350×g离心10 min，弃上清；③加入红细胞裂解液 (5 mL/克肿瘤)室温裂红3～5 min，用含血清培养基终止裂红；加入PBS充分洗涤及离心，弃上清。

2 流式染色 ① 加入培养基重悬细胞后用台盼蓝染色计数，记录细胞密度与活力；②根据染色方案，每孔转移1×106个细胞入96孔V底板；③加入PBS充分洗涤及离心，弃上清。④死活染料FVS780用PBS 1 ∶1 000稀释后每孔加入100 μL，室温避光放置10～15 min；加入PBS充分洗涤2次，4°C 350×g离心5 min，弃上清；⑤Fc受体阻断剂用流式缓冲液1 ∶200稀释后每孔加入100 μL，4 ℃避光孵育20 min；加入流式缓冲液充分洗涤及离心，弃上清。⑥每孔100 μL加入对应的抗体混合物进行细胞膜染，4 ℃避光孵育40 min；加入流式缓冲液充分洗涤及离心，弃上清；⑦根据染色方案，需要核内染色的样品孔用转录因子和核蛋白试剂进行固定、破膜与染色。加入破膜缓冲液充分洗涤及离心，弃上清。最后加入流式缓冲液充分洗涤及离心，弃上清；⑧细胞用4%多聚甲醛固定，4 ℃避光孵育30 min；加入流式缓冲液充分洗涤及离心，弃上清；⑨每孔细胞加入200 μL流式缓冲液重悬，4 ℃避光储存；⑩处理后样本上流式细胞仪检测。

四、统计学分析

结 果

一、NCSLC患者肿瘤组织与癌旁组织中细胞细胞比率比较(见表1)

表1 NSCLC患者肿瘤组织及癌旁组织中细胞、细胞比率

二、NCSLC患者肿瘤组织与癌旁组织中Treg细胞比率细胞中Treg细胞比率、TIL细胞比率的比较 (见表2)

表2 NSCLC肿瘤组织及癌旁组织中Treg细胞占总细胞比率、Treg细胞占细胞比率、TIL细胞比率

三、NCSLC患者肿瘤组织与癌旁组织中G-MDSC、M-MDSC细胞、Macrophages、CD163+ Macrophages(M2)细胞比率的比较(见表3)

NCSLC 患者肿瘤组织中G-MDSC细胞比率较癌旁组织升高(P>0.05)。NCSLC 患者肿瘤组织中M-MDSC细胞比率较癌旁组织升高(P<0.01)。NCSLC 患者肿瘤组织中总Macrophage细胞比率较癌旁组织降低(P<0.01)。NCSLC 患者肿瘤组织中CD163+ Macrophage(M2)细胞比率较癌旁组织升高(P>0.05)。

四、不同临床病理特征的NSCLC患者肿瘤组织中各细胞比率的比较(见表4)

NCSLC 患者肿瘤组织中Treg细胞占总T细胞比率、TIL、G-MDSC、M-MDSC、Macrophages和CD163+ Macrophages(M2)细胞比率与患者性别、年龄、肿瘤病理类型、肿瘤分期、肿瘤大小以及肿瘤是否伴有淋巴结转移均无关，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 NSCLC肿瘤组织及癌旁组织中G-MDSC、M-MDSC、Macrophages、CD163+ Macrophages(M2型)细胞比率{% , P50(IQR)}

表4 NSCLC患者肿瘤组织中各细胞比率与不同临床病理特征的相关性

表4(续) NSCLC患者肿瘤组织中TIL细胞比率与不同临床病理特征的相关性

表4 (续) NSCLC患者肿瘤组织中G-MDSC、M-MDSC细胞比率与不同临床病理特征的相关性{% , P50(IQR)}

表4(续) NSCLC患者肿瘤组织中Macrophages、CD163 Macrophages(M2)细胞比率与不同临床病理特征的相关性{% , P50(IQR)}

讨 论

肿瘤的产生、发展、侵袭和转移并非单一因素所造成，其中涉及到多种要素的共同作用，而免疫监视和免疫耐受的失衡是肿瘤形成的基本因素。Christelle等人的免疫表型研究证实，晚期肺部肿瘤患者机体内环境呈现免疫抑制的状态[5]。

研究表明MDSC除了具有固有的免疫抑制的功能外，MDSCs还与巨噬细胞和树突状细胞(DC)在肿瘤微环境中相互作用并交叉促进其免疫抑制活性[16]。Yoshikane[17]等人通过检测可切除NSCLC患者肿瘤及循环中MDSC细胞表达水平发现，NSCLC患者与正常人相比，循环单核细胞(M-MDSCs)的表达水平显著增加。本研究结果也提示，在NSCLC患者肿瘤组织中，M-MDSC表达水平较癌旁正常组织升高，结果具有统计学意义Argyropoulos[18]在有关于MDSC在MF(蕈样肉芽肿)中表达及其意义的研究中发现，晚期MF样本与早期MF样本的循环G-MDSC水平没有差异，但总体生存分析显示，肿瘤内MDSC富集的MF患者比无MDSC的患者生存期短，循环中G-MDSC水平高的患者预后也明显较差，此外，循环中的G-MDSC水平与临床分期无显著相关性。最新一项研究对53例接受nivolumab治疗的晚期NSCLC进行血液分析，结果提示高G-MDSC水平和低CD8/G-MDSC比值与NSCLC免疫治疗的疗效具有显著相关性，阐述了G-MDSC作为NSCLC患者接受免疫检查点抑制剂的潜在生物标志物具有重要意义[19]。同样的，在建立的小鼠模型中，当小鼠4个月大时在肺部出现肿瘤病变后，能够观察到免疫抑制性MDSC的积聚，而当敲除S100A9基因后，两种模型中MDSC的积累均被消除，同时小鼠的存活率也获得了显著提高，提示了MDSC在肿瘤的形成全过程中具有重要的意义[20]。本研究结果发现MDSC与NSCLC患者的性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、淋巴结是否转移等临床病理特征均无明显相关性，可能是由于MDSC与其他免疫抑制细胞(如Treg细胞和TAMs)不同，MDSC没有统一的分子表型。其次，不同MDSC亚型与肺癌预后的关系结果也不一致[21]。此外，由于本研究标本送检途中经低温保存，而此前有研究提示，实验标本经冻存后将导致两个MDSC亚群的频率明显降低[22]，因此本实验数据可能稍有偏差，因此导致结果的偏移。

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)根据细胞表型可分为经典活化巨噬细胞(M1型)和替代性活化巨噬细胞(M2型)，M1型巨噬细胞主要通过分泌释放促炎症反应细胞因子、效应分子以及趋化因子，从而发挥杀伤细菌、抗肿瘤、激活免疫应答的功能；M2型巨噬细胞则通过分泌IL-4/10等多种抗炎症反应因子，并且通过介导血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)等细胞因子的分泌，促进血管生成、淋巴管生成、组织重建以及损伤修复作用，并且通过 Th2 细胞应答，抑制免疫应答，为肿瘤的发生发展及转移过程提供了促进作用[23-24]。有研究测定了41例肺癌标本的瘤内微血管计数和巨噬细胞密度，并与患者的临床预后进行了相关分析，结果提示TAM的密度与肿瘤微血管的密度具有相关性，巨噬细胞与癌细胞共培养后显著增强了肺癌细胞株的细胞侵袭能力，这一结果提示TAM与肿瘤的进展有相关性。在机体的正常免疫系统内，M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞处于一种相对的功能平衡的状态，一旦机体出现肿瘤细胞的浸润，随着肿瘤逐渐向恶性进展，巨噬细胞的细胞表型会由M1型发生极化转变为M2型，促进肿瘤的形成[25]。吴鹏[26]的研究发现通过JQ1抑制IL-4诱导的巨噬细胞向M2型的极化后，可以明显降低M2型巨噬细胞对肿瘤细胞迁移能力的促进作用，同时小鼠模型的乳腺原位肿瘤的生长速率及肺转移率也获得了明显降低。本研究用CD163标记M2型巨噬细胞，结果发现肿瘤组织中M2型巨噬细胞表达水平较癌旁正常组织升高，但结果无显著差异。此前有针对乳腺癌组织中巨噬细胞的研究发现，M2型巨噬细胞也存在于无明显炎症反应的癌症中，当肿瘤逐渐向恶性转变时，巨噬细胞大量向良性肿瘤的部位聚集[25]。这或许可以解释在NSCLC肿瘤组织中总的巨噬细胞表达水平较癌旁组织中低的原因，我们的研究结果可能提示随着肿瘤的进展过程，M2型巨噬细胞逐渐向肿瘤外扩散迁移，从而诱导NSCLC肿瘤细胞的侵袭与转移。总的来说，综合此前的研究来看，我们可以认为，巨噬细胞与NSCLC的进展息息相关，但是值得庆幸的是，我们已经了解了巨噬细胞在肿瘤的形成过程中的主要机制，因此，认为通过有效控制M1型巨噬细胞向M2型的极化过程，或许是一种新的研究方向，为临床肿瘤的治疗带了新的想法。