热层析成像在乳腺癌模型早期筛查中的应用价值

薛小伟，李俊来，薛少伟，张 程

中国人民解放军总医院 1第二医学中心超声科 2第一医学中心超声科，北京 100853

据世界卫生组织2018年统计报告分析，乳腺癌在中国女性癌症发病率为首位，死亡率为第2位(http：//gco.iarc.fr/today/data/factsheets/populations/160-china-fact sheets.pdf)。虽然乳腺癌5年生存期较高，但是其逐年增长的发病率及年轻化严重影响患者的健康及生活质量，因此，对乳腺癌的早期筛查及生长机制研究很重要。热层析成像技术能够在选定区域观察逐层热源的强度变化，通过了解不同深度的热变化体现不同深度的病变[1-2]。双模态热层析成像技术能够通过体外成像反应肿瘤内部血管分布情况，有助于了解微观血管与乳腺癌产热的作用，反应的功能学特点表现在形态结构改变之前，具有早期发现恶性肿瘤的能力[1，3-5]。本研究分别用NOD/SCID小鼠和普通SD大鼠进行人源化乳腺癌模型及鼠源大鼠乳腺癌模型建立，分别验证热层析成像对于乳腺癌的早期筛查能力。

材料和方法

材料及设备NOD/SCID小鼠4～6周龄共35只，体重16～20 g(北京维通利华实验动物技术有限公司)、SD大鼠4～6周龄共20只，体重60～80 g(北京维通利华实验动物技术有限公司)，饲养于中国人民解放军总医院层流无菌动物房。人乳腺癌231细胞由中国人民解放军总医院肿瘤中心实验室提供，大鼠乳腺癌MADB106细胞购于中国典型培养物保藏中心细胞库，磷酸缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)、RIPM1640培养基、血清、胰蛋白酶、细胞冻存液、4%多聚甲醛、1%戊巴比妥、气体麻醉剂、1 ml注射器、天平、游标卡尺等购于北京远航景轩科贸有限公司，热层析分析仪(HB-T-2A)购于武汉昊博科技有限公司，超声诊断仪(VINNO 70)购于飞依诺科技有限公司，Philips iU22、超声造影(Philips iU22)购于飞利浦(中国)投资有限公司。

细胞培养使用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基培养细胞，放置于37 ℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中静置培养。每个100 mm 平皿加入10 ml 培养基，每个25 cm2瓶加入4 ml 培养基，每个60 mm 平皿加入3 ml 培养基，每个6孔板每孔加入2 ml培养基。

体外成瘤生长状态良好的细胞用胰酶消化并计数，用无血清培养基调整细胞浓度为5×107个/ml。NOD/SCID小鼠、SD大鼠各分为两组，分别为空白对照组、实验组。在实验组NOD/SCID小鼠背部、SD大鼠一侧乳房垫内各注射细胞悬液100 μl，空白对照组注射等量的PBS溶液；第2天开始麻醉，大鼠脱毛膏脱去毛发，用超声及热层析检测；测量肿瘤大小达1 cm左右时进行超声造影检查；肿瘤达到1～2 cm时取肿瘤组织，4%多聚甲醛固定，以备免疫组织化学染色观察肿瘤血管形成情况。

热层析成像实验时室温保持在22 ℃～25 ℃，湿度45%～70%，实验时保持室内空气稳定无对流，避免气流直接吹至检查部位及受检者与摄像头之间。小鼠或大鼠先麻醉后，充分暴露乳腺及肿瘤部位。使用乳腺成像预设值条件，探测仪距老鼠2 m，采集图像。利用两种动物模型进行验证。首先，利用NOD/SCID小鼠建立人源化乳腺癌动物模型，注射乳腺癌细胞后每天进行热层析及超声检查。随后利用SD大鼠建立乳腺癌模型，注射大鼠乳腺癌MADB106细胞后即刻进行热层析和超声检查。之后每2～3天同时进行热层析及超声检查。

统计学处理采用SPSS 19.0软件及Image Pro Plus 6.0[6]进行统计分析。用Image Pro Plus 6.0软件分析阳性反应区的平均光密度值。每组参数之间差异用t检验或单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

NOD/SCID小鼠肿瘤模型结果热层析技术可以早于普通超声4 d发现肿瘤(图1)，热层析成像诊断的准确率高于普通超声[86.2% (25/29只，死亡6只)比 55.2%(16/29只，死亡6只)]。多普勒超声提示肿瘤部位血流信号不丰富。随后对肿瘤进行超声造影检查，发现肿瘤内无造影剂灌入，但是利用热层析成像中的血管显化功能时均可见肿瘤内部数条粗大血管(图2)。

SD大鼠肿瘤模型结果在SD大鼠模型中，注射肿瘤细胞第6天时肉眼及热层析可发现肿瘤组织。超声于第8天发现注射部位小肿瘤，晚于热层析2 d(图3)。

肿瘤组织中血管形态及数量肿瘤组织免疫组织化学染色结果显示，肿瘤内部CD34表达增加，血管形成增多且不规则；正常对照组乳腺组织内血管分布、走形都很规则，且数目不多(图4)。统计分析显示肿瘤(2 cm和1 cm左右)内血管指标CD34表达的平均光密度值明显高于正常乳腺组织内CD34表达的平均光密度值(453.52±1101.08 比31.74±53.85，P<0.0001和73.29±136.92 比31.74±53.85，P=0.006)。

箭头：肿瘤区域
arrows：tumor area
A. 第5天小鼠模型热层析及超声图；B. 第9天小鼠模型热层析及超声图
A. the thermal tomography and ultrasound images of a mouse model on the fifth day；B. the thermal tomography and ultrasound images of a mouse model on the ninth day
图1NOD/SCID乳腺癌模型热层析成像及超声
Fig1Thermal tomography and ultrasound of breast cancer in NOD/SCID mouse models

箭头：肿瘤区域
arrows：tumor area
A. NOD/SCID乳腺癌模型小鼠肿瘤部位超声造影图；B. NOD/SCID乳腺癌模型肿瘤部位热层析血管显化图
A. contrast-enhanced ultrasound image of tumor site of a NOD/SCID mouse model；B. thermographic vascular manifestation map of NOD/SCID tumor site
图2肿瘤部位超声造影及热层析血管显化图
Fig2Contrast-enhanced ultrasound and thermography of vessels at tumor sites

箭头：乳腺肿瘤
arrows：breast tumor
A.对照组大鼠注射磷酸缓冲液时、第6天及第8天时热层析和超声图；B. 实验组大鼠注射乳腺癌细胞时、第6天及第8天时热层析和超声图
A. the thermal tomography and ultrasonography of rats in the control group when phosphate buffered solution was injected，on the 6th day，and on the 8th day；B. the thermal tomography and ultrasonography of the rats in the observation group when breast cancer cells were injected，on the 6th day，and on the 8th day
图3大鼠乳腺癌模型热层析及超声图
Fig3Thermal tomography and ultrasound of a rat model of breast cancer

A. 肿瘤组织(免疫组织化学染色，×200)；B. 正常乳腺组织(免疫组织化学染色，×200)
A. tumor tissue (immunohistochemical staining，×200)；B. normal breast tissue (immunohistochemical staining，×200)
图4SD大鼠肿瘤内部CD34表达情况
Fig4The expression level of CD34 in an SD rat model with breast cancer

讨 论

乳腺肿瘤是临床最常见的疾病之一，从青春期到老年均为常见。2018年据世界卫生组织统计，乳腺癌在中国女性肿瘤发病率中占首位，死亡率仅次于肺癌(http：//gco.iarc.fr/today/data/factsheets/populations/160-china-fact sheets.pdf)。因此，乳腺癌早期与精确诊断是提高其治愈率及改善患者生存质量的关键。依靠高科技手段提高乳腺癌的早期检出率，一直是医学界关注和研究的热点。研究表明若能早期发现和做出正确诊断，并采取相应的治疗措施，可极大提高治愈率和生存率[7]。现有诊疗设备如超声、乳腺X线摄影、核磁共振等在目前临床诊断和术后评估方面发挥了重要作用，但在肿瘤早期检测方面还存在着不足，这给现代影像技术提出了更高的要求，同时赋予影像工作者更艰巨的任务和挑战。

热层析技术是利用现代生物传热理论由体表温度分布获取生物体内部热信息的一种医学分析新技术[8]。这项技术的优点包括：(1)能够探测因生理或病理异常改变引起的约0.05 ℃的微小温度变化—功能学即代谢改变早于形态学改变；(2)功能学与形态学的完美融合，原位、实时、动态检测和定性、定量分析是影像学与热层析曲线的完美结合；(3)无接触、无创伤、无辐射，检测不超过5 min，特别适于体检、普查和复查[9-11]。本研究利用热层析成像技术对乳腺癌动物模型进行早期检测，观察乳腺癌发生早期的生长状况，探讨乳腺癌细胞在生物体内的生长趋势及其特征，并与目前我国常用的超声筛查手段进行比较，以期发现更小、更早期的乳腺癌病变，结果显示热层析可以早于超声2～4 d发现肿瘤的形成，提示热层析可以在肿瘤生长早期即可探测到其变化，可以较早期地显示肿瘤部位与周围正常组织的差异，而且较超声准确度提高。同时热层析对肿瘤内部血管显像比彩色多普勒及超声造影更敏感。由于NOD/SCID小鼠乳腺非常小，同时没有毛发及皮下脂肪层，本研究利用正常大鼠建立乳腺癌模型，同样注射肿瘤细胞即刻及2～3 d进行超声及热层析成像，结果显示热层析可以早于超声2 d发现肿瘤，与NOD/SCID乳腺癌模型结果相符。与临床实验不同的是，动物模型肿瘤热层析成像表现为黄色或绿色低温，分析原因可能是由于老鼠乳腺太小且没有皮下脂肪层或皮下脂肪层太薄等原因，但是肿瘤部位温度与周围组织温度有明显差异，正是由于这种温度差异才能分辨出肿瘤，与临床应用相符。组织病理对照显示肿瘤组织中的血管表达丰富且不规则，血管走形异常，长且粗，因此进一步证明肿瘤组织代谢旺盛，产热增加，为肿瘤提供生长所需的营养，是热层析技术检查乳腺癌的基础[12]。因此，在SD大鼠乳腺癌模型中，热层析成像同样可以早于超声发现乳腺癌，与NOD/SCID乳腺癌模型结果一致，有潜在的筛查乳腺癌的应用价值。

综上，乳腺癌生长代谢速度快，局部温度高，且肿瘤部位的温度变化远早于肿瘤大小的变化。超声主要是对肿瘤的大小、形态及内部回声进行检查及诊断，不能反应肿瘤生长及代谢方面的特征。通过动物实验显示热层析利用肿瘤生长及代谢产热这一原理进行成像，能够更敏感地发现乳腺癌，具有比超声更早发现乳腺异常的潜力，未来可用于临床乳腺癌筛查，具有较大临床应用潜力。乳腺超声检查在我国是筛查乳腺癌的最基本最常用的影像学方法，动物实验结果表明热层析仪可以早于超声发现动物模型中的乳腺癌。因此，热层析成像具有早期发现早期诊断乳腺癌的潜能，这一功能将为临床医生更早地提供病变性质的证据，早期发现乳腺癌，从而得到早期治疗，进一步提高患者生活质量。