常规超声结合剪切波弹性成像技术对兔坐骨神经挤压伤的定量评估

朱亚琼，金 壮，陈思明，任 玲，王月香，田晓琦，罗渝昆,2

1中国人民解放军总医院超声科，北京 100853 2南开大学医学院影像医学与核医学专业，天津 300071

周围神经损伤是致残的常见原因[1]。它可由挤压伤、穿透伤、牵拉伤以及各种交通事故等引起[2]，致使轴突、髓鞘及神经纤维束受到不同程度的损伤[3]。周围神经损伤同时可伴有失神经支配的肌肉发生进行性萎缩，可能造成长久的功能丧失，降低生活质量，加重社会负担[4]。常规超声对周围神经损伤的评价具有较高的价值[5-6]。常规超声可准确定位损伤神经，测量横截面积，并探查神经的连续性、回声及移动性[7]。然而，常规超声无法评估损伤神经的硬度变化，且神经横截面积作为常规超声检测的主要定量指标，其与神经修复状况的相关性较差，从而在临床应用受限[7]。因此，需采用新的超声技术结合常规超声对损伤神经进行较为全面的评估。

剪切波超声弹性成像技术(shear-wave elastography，SWE)是新近发展的能定量评估组织硬度的新技术，突破了常规解剖结构显像的局限性，近年开始用于肝脏、乳腺、甲状腺、淋巴结及前列腺等疾病的相关研究[8]。初步研究结果显示其在区分良恶性病变及肝纤维化分期方面具有潜在的临床应用价值[9]。然而，在周围神经损伤疾病中，SWE检测目前多集中在腕管综合征的临床研究[10]，在外伤性周围神经挤压伤的研究鲜有报道。本研究旨在探讨挤压伤坐骨神经及失神经支配肌肉的常规超声及弹性模量的变化，并将超声结果与组织病理学结果进行比较，以期为今后的临床应用提供参考依据。

材料和方法

动物分组及模型建立雄性健康新西兰大白兔40只，体重2.5～3.0 kg，鼠龄4～6个月，由中国北京隆安动物繁育中心提供[许可证号：SCXK(Jing)2014-0003]，经动物管理和伦理委员会审批。实验前3 d饲养于实验室以适应环境，温度控制在20～22 ℃，并实行12 h光照和12 h黑暗交替。将40只家兔随机分为对照组、挤压伤后2周组、4周组和8周组，每组10只。所有家兔均肌肉注射盐酸赛拉嗪(陆眠宁，中国吉林长春兽医研究所，0.2 ml/kg体重)麻醉，而后右下肢备皮并固定于手术台。沿右侧大腿中部水平做纵向皮肤切口，暴露坐骨神经约3 cm长。在坐骨结节下方1 cm处将无菌塑料导管剪成的圆片固定在其旁的肌肉上作为标记。挤压伤组在标记下方1 cm处用持针器(内径5 mm宽)夹持神经，锁至第三扣，钳夹持续30 s后解除，然后紧挨此处再次钳夹，共造成神经损伤长度约10 mm。钳夹解除后可见神经菲薄，呈半透明状，分层缝合切口。术后均给予抗生素抗炎治疗(青霉素800 000 IU/次，共5次)。

超声检查两名经验丰富的超声医师(医师一：12年超声工作经验和4年超声弹性成像研究经验；医师二：8年超声工作经验和3年超声弹性成像研究经验)对40只兔右侧坐骨神经及右侧小腿三头肌行常规超声及SWE检测。检查者对动物模型建立的全程不知情。

常规超声检查采用Mindray (Resona 7)超声诊断仪，线阵探头，频率4～15 MHZ。检查前用盐酸赛拉嗪0.2 ml/kg麻醉家兔，置于左侧卧位，右下肢自然伸直。超声探头在横断面通过神经旁高回声导管识别神经损伤处，而后旋转90度，纵切面仔细扫查神经损伤区域，观察坐骨神经的连续性、内径、回声强度及与周围组织的关系。测量神经最厚处，测量5次，取平均值进行统计学分析。小腿三头肌最大厚度均在横断面扫查，以腓肠肌和比目鱼肌的边界为参照，测量5次，取平均值进行统计学分析。

剪切波弹性成像检测采用法国声科(Supersonic Imagine，Aixen-Provence，France)超声诊断仪，线阵探头，频率2～10 MHZ。检查前麻醉家兔，检查时涂以充足的耦合剂，并将探头轻放置皮肤表面。灰阶超声模式下通过高回声导管识别神经损伤处及失神经支配的小腿三头肌，纵向左右侧动探头至图像显示至最佳切面。开启弹性模式，将感兴趣方形区域分别置于神经损伤处及小腿三头肌肌腹中部，图像稳定3～5 s后冻结。弹性值测量时，坐骨神经感兴趣区(region of interest，ROI)大小为直径1 mm，置于损伤处[10]，避免超出神经外膜，测试5次，测量深度为10～20 mm，取平均弹性模量值(单位：kPa)；小腿三头肌ROI大小为直径10～11 mm，置于肌腹中部，避开下方骨组织测量，测量深度为5～15 mm，取5次弹性模量测量值的平均值。

小腿三头肌湿重比过量麻药处死各组家兔，取双侧小腿三头肌，用电子天平测量小腿三头肌湿重(g)，计算小腿三头肌湿重比(右侧小腿三头肌湿重/左侧小腿三头肌湿重)。

组织学评估

Masson染色：术后2、4、8周，处死各组家兔。取右侧坐骨神经及右侧小腿三头肌(肌腹处0.5 cm×1 cm×0.5 cm切块)。将标本固定于4%多聚甲醛溶液，石蜡包埋。坐骨神经纵向切片，小腿三头肌横向切片，均4 μm厚，行Masson染色。光学显微镜下放大至200倍观察，并采用Image Pro+6.0软件计算10个随机视野损伤处坐骨神经及小腿三头肌胶原纤维面积百分比。组织学评估由1名病理科医师完成，其对实验全过程不知情。

免疫荧光染色：冰冻切片机横切神经，4 μm厚，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)洗涤3次，每次5 min，用10%山羊血清PBS室温封闭2 h。分别滴加NF200抗体 (1∶400，N5389，Sigma)、S100抗体 (1∶200，S2657，Sigma)作为一抗，切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜。次日，用PBS洗涤3次，每次5 min，滴加二抗Alexa 488 和Alexa 594，室温孵育1 h。PBS洗涤3次后，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚复染雪旺细胞核。使用荧光显微镜拍照(Nikon，Eclipse C1，Japan)。

统计学处理采用SPSS 19.0 统计软件，符合正态分布计量资料以均数±标准差表示。计量资料呈正态分布且方差齐，两样本均数比较采用t检验，非正态分布、方差不齐数据组间比较采用非参数秩和检验。多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。组内相关系数评估测试的一致性，以95% 置信区间(confidence interval，CI)表示。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

挤压伤神经的超声评价

常规超声评价结果：正常神经表现为均匀低回声的管状结构，内有较强的线状平行回声结构。神经外膜表现为平滑连续的高回声。坐骨神经损伤后，线性回声连续性部分中断，中断区回声减低，神经外膜与周围组织分界欠清，内径增粗，于挤压伤后2周达到峰值[(1.65±0.34)mm]，较对照组[(0.97±0.15)mm]显著增厚(t=5.79，P=0.00)；而后逐渐恢复，损伤后8周恢复至接近正常水平[(1.12±0.18 mm)，t=2.02，P=0.06]，损伤区连续性尚可，与周围组织分界欠清。

SWE评价结果：对照组坐骨神经弹性模量为(8.75±1.02) kPa，神经挤压伤后神经硬度逐渐增加，损伤2～4周，损伤处神经弹性模量迅速增加，分别为(14.77±2.53) kPa、(19.12±3.46) kPa，两组差异无统计学意义(t=3.22，P=0.06)，但较对照组显著增加 (P=0.00)；损伤8周，神经硬度最高为(28.39±5.26) kPa，较对照组及损伤2～4周组差异均有统计学意义 (F=58.05，P=0.00)(图1)。两名超声医师具有较好的测试一致性(表1)。

挤压伤神经的组织病理学评价

Masson染色：与对照组(8.74±1.91)%相比，神经挤压伤后2、4、8周损伤处神经内胶原面积百分比逐渐增加，分别为(18.35±4.48)%、(25.60±5.07)%和(33.49±6.26)%，各组间差异有统计学意义(F=50.15，P=0.00)(图2)。

免疫荧光染色：对照组轴突、髓鞘排列规则、紧密，分布均匀，髓鞘包绕轴突。神经损伤2周后轴突发生再生，再生轴突小，分布松散、不均匀，髓鞘少且不完整。随着时间变化，损伤后8周轴突、髓鞘均逐渐增多，但较对照组仍稀少、排列不规则，分布不均匀(图3)。

小腿三头肌的超声评价

高频超声评价结果：坐骨神经损伤后，随时间变化，失神经支配的小腿三头肌厚度逐渐变薄，由(12.05±1.16) mm 减小至 (4.72±0.49) mm，较对照组比较差异有统计学意义(t=18.41，P=0.00)。

A.对照组；B. 挤压伤后2周组；C.挤压伤后4周组；D.挤压伤后8周组
A. control group；B. 2-week crush injury group；C. 4-week crush injury group；D. 8-week crush injury group
图1不同时间点损伤处神经弹性模量
Fig1The elastic modulus of crushed sciatic nerve at different time points

蓝色区域为增生胶原纤维
The blue areas are collagen fibers
A.对照组；B. 挤压伤后2周组；C.挤压伤后4周组；D.挤压伤后8周组
A. control group；B. 2-week crush injury group；C. 4-week crush injury group；D. 8-week crush injury group
图2不同时间点坐骨神经Masson染色表现 (×200)
Fig2Masson staining of sciatic nerve at different time points (×200)

红色：轴突；绿色：髓鞘；蓝色：细胞核
red：axons；green：myelin sheath；blue：nuclei
A.对照组；B. 挤压伤后2周组；C.挤压伤后4周组；D.挤压伤后8周组
A. control group；B. 2-week crush injury group；C. 4-week crush injury group；D. 8-week crush injury group
图3坐骨神经免疫荧光染色 (×100)
Fig3Immunofluorescence staining of sciatic nerve (×100)

SWE评价结果：神经损伤后2周内小腿三头肌的弹性模量由(20.52±3.41) kPa降至(15.33±2.66) kPa，较对照组显著减低 (t=3.80，P=0.00)。2周后逐渐增高，8周时弹性模量为(30.15±4.94) kPa，较其他时间点及对照组显著增高 (F=23.80，P=0.00)(图4)。两名超声医师具有较好的测试一致性(表1)。

小腿三头肌的组织病理学评价小腿三头肌湿重百分比随时间变化逐渐降低，各时间点湿重百分比较对照组差异有统计学意义(F=47.69，P=0.00)。Masson染色显示肌纤维横截面积由(2752.57±245.33) μm2减小至(592.26±55.37) μm2(t=27.16，P=0.00)(图5)。小腿三头肌胶原面积百分比由(2.78±0.85)%增加至(12.42±2.30)%(t=12.43，P=0.00)(图5)。

A.对照组；B. 挤压伤后2周组；C.挤压伤后4周组；D.挤压伤后8周组
A.control group；B. 2-week crush injury group；C. 4-week crush injury group；D. 8-week crush injury group
图4不同时间点小腿三头肌弹性模量
Fig4The elastic modulus of triceps surae muscle at different time points

表1 两名超声医师检测的剪切波弹性成像参数的一致性Table 1 Intraclass correlation coefficients of shear-wave elastography parameters examined by two radiologists

ICC：组内相关系数
ICC：intraclass correlation coefficient

A.对照组；B. 挤压伤后2周组；C.挤压伤后4周组；D.挤压伤后8周组
A.control group；B. 2-week crush injury group；C. 4-week crush injury group；D. 8-week crush injury group
图5不同时间点小腿三头肌Masson染色表现 (×200)
Fig5Masson staining of triceps surae muscle at different time points (×200)

讨 论

周围神经挤压伤在临床较为常见，损伤后的早期诊断对预后尤为重要。本研究显示坐骨神经挤压伤后早期水肿增厚，而后逐渐恢复至接近正常水平，但神经的弹性模量随时间变化处于逐渐增加的趋势，提示神经硬度高，与二维超声提示的神经恢复状态结果相反。因此常规超声对周围神经损伤的评价具有一定的局限性。

本研究发现剪切波弹性成像技术可为周围神经挤压伤的评估提供有用的信息。神经损伤后弹性模量较对照组逐渐增高，Masson染色显示神经内部胶原纤维面积随时间变化增加显著。神经硬度的增加可能与内部胶原纤维增多有关。神经挤压伤后，神经水肿造成神经内部压力升高，髓鞘发生Wallerian变性，神经增厚，回声信号减少，神经外膜和神经束膜显示不清；损伤神经内压力的增加阻碍神经内的微循环，致使成纤维细胞凋亡[11-12]，受损神经内胶原纤维及瘢痕组织沉积、轴突再生受阻，可能造成神经弹性模量增加[13]。因此，剪切波超声弹性成像技术是评价周围神经损伤的重要补充手段。

由于既往缺乏兔模型坐骨神经损伤后神经弹性评价的研究，无法将SWE结果与文献进行比较。一些关于外周神经弹性的研究，主要集中在腕管综合征的正中神经、尺管综合征的尺神经和糖尿病多神经病变的胫神经。Zhang等[14]采用SWE联合二维超声诊断腕管综合征的灵敏度和特异度均高于单独使用此两种技术。Kantarci 等[15]对37例腕管综合征患者及18例健康人正中神经的对比研究进一步证实了上述结论，且发现腕管综合征患者正中神经在腕管入口处明显增高，重度组(101.4 kPa)高于轻度组(55.1 kPa)。Paluch等[16]发现尺管综合征患者尺神经硬度明显高于对照组(99.41 kPa 比49.08 kPa，P<0.001)，两组在前臂远端和前臂中段水平的弹性模量差异无统计学意义；然而当肘管与前臂远端尺神经硬度比值是肘管与前臂中段尺神经硬度比值的1.5倍时，对尺管综合征的检测具有较高的敏感性和特异性。Dikici等[17]报道，根据临床检查及电生理检查诊断为糖尿病周围神经病变的患者，胫神经硬度远高于健康对照组和无周围神经病变的糖尿病患者，内踝近端4 cm处胫神经弹性模量截断值为51.05 kPa，对周围神经病变的诊断灵敏度为90.0%、特异性为85.0%，均优于胫神经横断面积的测量。

SWE已被用于脑卒中、肌腱撕裂等疾病的肌肉僵硬度的检测[18-19]，少有研究探讨其在失神经支配肌肉萎缩中的作用。本研究采用SWE测量失神经支配小腿三头肌的弹性模量，发现在神经损伤后2周内弹性模量较对照组下降，可能是损伤早期失神经支配肌肉内血容量增加及细胞外液增多所致[20-21]；随后的6周弹性模量逐渐增加，组织病理学检测发现肌肉失神经支配后其内胶原纤维面积逐渐增大，同时肌纤维横截面积逐渐减小，与Ashley等[22]及 Fanbin 等[23]的研究结果一致，因此，胶原纤维的增加可能导致失神经支配肌肉弹性模量的增加。

本研究发现SWE在检测神经病变方面具有较好的重复性，与前人研究结果一致[17，24]。Dikici等[17]评估不同检测者应用SWE评估糖尿病周围神经病变患者的胫神经弹性模量，表明SWE在不同检测者之间具有良好的重复性。

本研究存在一些不足。首先，本研究未对损伤神经进行电诊断或MRN检查。其次，由于少有研究应用SWE检测周围神经挤压伤，本研究发现无法与其他相关研究结果进行比较。第三，观察者间一致性的评价是基于具有丰富弹性超声经验的医师，然而，对于经验丰富的超声医师和初级超声医师间的测量一致性未进行研究。

综上，剪切波超声弹性成像技术可监测挤压伤神经及失神经支配肌肉的生物力学性能的变化，具有潜在的临床评估价值和较好的重复性。常规二维超声定量结合SWE成像可为周围神经挤压伤的评估提供有效参数。