高压气腹对老龄小鼠腹腔探查手术术后认知功能的影响

胡慈贤 蒋婧妍 孟波 叶海旺 安秀君 李晓瑜 秦金玲 陈骏萍 卢波

术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）会延长住院时间，增加住院费用，严重影响患者术后康复和远期生存质量，成为老年患者术后生活障碍和死亡的重要原因。手术创伤可引起系统性炎症介质释放，成为引起中枢神经炎症的主要致炎因子，腹腔镜手术所必需的高压力气腹同样可造成系统性炎症介质释放增加[1-2]。鉴于中枢神经炎症与POCD的发生、发展密切相关[3-4]，气腹引起的系统性炎症介质释放是否会使手术麻醉引起的认知功能损伤恶化？对此，目前尚无相关研究进行分析和探讨。因此，本研究拟通过动物实验观察腹腔镜气腹对手术麻醉所致POCD的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性清洁级ICR小鼠64只，12～14月龄，由浙江省医学科学院实验动物中心提供。本研究获得宁波大学实验动物伦理委员会批准。所有实验动物均饲养于宁波大学SPF级实验动物中心。主要仪器：R540SP型小动物麻醉机（中国瑞沃德公司）；小动物气腹机（德国Karl Storz公司）；条件恐惧行为学测试箱（中国欣软公司）。

1.2 分组 将64只小鼠随机分为正常组（N组）、手术组（S组）、手术+低压气腹组（L组）和手术+高压气腹组（H组），N组不进行任何干预，S组接受腹腔探查手术，L组和H组进行模拟气腹实验后接受腹腔探查手术。每组再分两个亚组（8只一组），分别于手术后第3天（3d）和第7天（7d）进行行为学测试。

1.3 麻醉方法与围术期管理 小鼠术前禁食24h，不禁饮。使用七氟烷小动物麻醉机，箱内七氟烷浓度调节至3%后，将小鼠放入箱内进行诱导，直至翻正反射消失，行气管插管。麻醉维持期调节七氟烷浓度为1.8%，空气流量为0.5L/min，保持自主呼吸，控制麻醉维持时间为0.5h。

1.4 气腹实施和气腹压力的设定 小鼠吸入麻醉后仰卧固定，消毒后将18号导管针插入左下腹，导管针末端经橡皮管接气腹机。将另一18号导管针插入右下腹，导管针末端经橡皮管接入一盛水烧杯，腹腔内气体经该管排出，盛水烧杯可防止空气进入腹腔，模拟临床手术漏气情况。参照文献[5]，分别设定2mmHg为低气腹压力，8mmHg为高气腹压力。气腹维持时间设定为30min。实验结束，关闭气腹机，经导管针排出腹腔残余气体。

1.5 腹腔探查模型 气腹实验结束后进行腹腔探查手术。于右肋下垂直于肋骨作一纵行切口，长约1cm，切口深至腹腔内。戴有无菌外科手套的手指伸入腹腔内进行探查约30s，取出约10cm的小肠至腹腔外，进行摩擦约30s，反复操作3次。用消毒器械和外科缝合线缝合伤口，切口处以0.5%罗哌卡因浸润镇痛。整个麻醉手术过程控制在15min以内，结束麻醉后待小鼠自然清醒。

1.6 行为学测试 分别于术后3d和7d开始依次进行新物体识别实验（novel object recognition，NOR）和条件性恐惧实验（fear conditioning，FC）。

1.6.1 NOR NOR 测试第 1天，将 A、B 两相同物体放入旷场箱内，让小鼠进行探索、训练5min；第2天，将B物体换为不同形状、质地的物体C，记录小鼠5min内对两物体的探索时间（T），并计算辨别指数（recognition index，RI）=TC/TA+TC。

1.6.2 FC 小鼠在完成NOR后开始进行FC。小鼠在无声黑暗试验箱内适应3min后，给予单一高频声音（30s，70dB，3kHz）刺激，随后给予足底电击（2s，0.7mA）刺激，刺激结束后恢复30s，循环2次后放回饲养笼。训练结束后24h，将小鼠再次放入实验箱内自由探索3min，不给予任何刺激，记录场景诱发僵直时间，主要反映海马依赖性恐惧记忆；2h后放入改造后实验箱（白色分隔板遮住通电栅栏，改变四周箱壁颜色），自由探索3min后，给予上述相同声音刺激3min，记录线索诱发僵直时间，主要反映非海马依赖性恐惧记忆。

1.7 统计学处理 采用Graphpad prism 7.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

4组小鼠术后3、7d NOR和FC结果比较 见表1。

4组小鼠术后3、7d的RI比较差异均有统计学意义（F=10.14、4.462，均 P＜0.05）。术后 3 d，S 组、L 组和H组的 RI均低于 N 组（均 P＜0.05）；术后 7 d，L 组和 H组的RI均低于 N组（均 P＜0.01）。4组小鼠术后 3、7d的场景诱发僵直时间比较差异均有统计学意义（F=11.28、10.45，均 P＜0.01）。S 组、L 组和 H 组术后 3、7d 的场景诱发僵直时间均低于N组（均P＜0.05），且H组低于L组（均P＜0.05）。4组小鼠术后3、7d的线索诱发僵直时间比较差异均有统计学意义（F=11.73、11.7，均 P＜0.01）。S组、L组和H组术后3、7d的线索诱发僵直时间均低于N组（均P＜0.05），且H组均低于L组（均P＜0.05）。

表1 4组小鼠术后3、7d NOR和FC结果比较

3 讨论

与传统的开放性手术相比，微创的腹腔镜手术具有显著的优势，包括减轻术后疼痛、缩短住院时间、降低病死率和快速康复。然而，腹腔镜手术并非没有内在器官的生理紊乱，腹壁受气腹正压扩张所致的机械性损伤会增加患者术中和术后的应激反应[6]。腹腔镜检查所需的正压气腹会显著降低腹腔内脏器的血流灌注，促使无氧代谢的形成，进而导致乳酸酸中毒、氧化应激和脏器功能的损伤[6-7]。Schietroma等[2]观察了不同气腹压（12～14mmHg vs 6～8mmHg）下行腹腔镜肾上腺切除术对外周炎症指标影响，发现高气腹压组术后白细胞介素（IL）-1、IL-6及CRP水平均显著升高。上述证据提示，气腹是腹腔镜手术创伤的一部分，高气腹压力可造成脏器功能的损伤和系统性炎症介质的表达增加。基于此，本研究通过对老年小鼠行腹腔探查手术建立POCD动物模型，与先前研究一致，腹腔探查手术会明显损害老年小鼠的物体识别记忆、海马依赖和非海马依赖的恐惧记忆。在此模型基础上，本研究进一步施加气腹干预以模拟临床上的腹腔镜“大手术”，结果发现H组小鼠的场景性恐惧记忆和线索性恐惧记忆损害均显著高于L组。

外科手术对机体产生巨大的创伤和应激，炎症介质（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）会在短时间内大量、快速的释放，引起局部炎症的同时，也使构筑血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的血管内皮细胞及其周围细胞激活[8-9]。这些细胞产生的扩大炎症级联反应对血脑屏障及脑组织产生损伤，使得外周炎症因子能直接突破中枢炎症反应区域的血脑屏障防御进入中枢神经系统并激活中枢的免疫相关细胞（如小胶质细胞），释放多种炎性介质，在参与中枢炎症的各组分间形成多组正反馈，进一步放大炎症信号，对中枢神经元造成损伤[8-10]，最终导致记忆和认知功能受损[11]。因此，笔者推测高压气腹通过促进外周炎症进展和增加BBB通透性，进而引起中枢炎症反应的形成和恶化手术麻醉引起的认知功能减退。对此假设的进一步验证是未来研究的一个重要方向。

本研究选择了目前POCD研究领域使用较为广泛的新物体识别实验和条件性恐惧实验来评估小鼠的认知功能。结果发现，术后3、7d时H组和L组之间的RI均无统计学差异，提示高气腹压对小鼠的物体识别记忆并未造成进一步的损伤，这与恐惧记忆实验的结果并不一致。笔者认为，POCD所损伤的认知功能涉及多个方面，累及的相关脑区也存在差异性，临床中通常使用多维度、多方面的评估量表来诊断POCD，因此动物研究也应该结合更多的行为学实验（如Morris水迷宫、旷场实验）来综合评估认知功能。在本研究的实验条件下，高压气腹可能更大程度的损伤了恐惧记忆，而对物体识别记忆无显著影响。

随着选择性肌松拮抗剂舒更葡糖钠的上市，针对腹腔镜手术是否应该常规应用深肌松技术的讨论愈发激烈。近来大量临床研究证实深肌松麻醉下使用低气腹压（8mmHg）即可满足大部分腹腔镜手术的操作视野[12]。然而，相关研究中的关注点更多集中于手术空间、手术视野、术后疼痛、快速康复等，尚未有研究将认知功能评估作为低气腹压的优势指标之一。然而事实上，随着外科技术的飞速发展，越来越多高龄患者接受长时间、大创伤的手术，此类患者是POCD的相对高发人群，虽然胡梦莹等[13]已有初步的探索性研究，但仍需大量针对低气腹压对术后认知功能影响的高质量临床随机对照试验对其进行深入的探讨。

综上所述，相比低气腹压，高气腹压力加剧手术麻醉所致的老龄小鼠恐惧记忆损害。