加州鲈源普通变形杆菌分离、鉴定及药敏分析

柯文杰，孙斌斌，覃华斌，袁富豪，盘赐光，杨映，于辉，陈言峰

（1.佛山科学技术学院广东省动物分子设计与精准育种重点实验室，广东 佛山 528231；2.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528231；3.珠海容川饲料有限公司，广东 珠海 519100）

加州鲈Micropterus salmoides 又名大口黑鲈，原产北美洲的江河、湖泊中，生长快、肉味鲜美、经济价值较高，已在许多国家和地区广泛养殖[1,2]。但是，随着养殖密度和养殖规模的不断扩大，加州鲈养殖环境日趋恶化，细菌性病害日益增多[3]。

普通变形杆菌Proteus vulgaris 是一种重要的条件致病菌，通常存在于爬行动物、鸟类、哺乳动物等的肠道中，可导致胃肠炎、脑膜炎、败血症等疾病，还会污染肉类和蛋类等食品,引起食物中毒、尿路感染和伤口感染[4-6]，对人类健康和养殖业发展具有潜在的危害。研究发现：普通变形杆菌能感染中华鳖Trionyx sinensis[6]、蛇[7]、大口鲇Silurus meridionalis－Chen[8]、猪[9]、鳄Crocodylus siamensis[10]和斑点叉尾Ictalurus punctatus[11]等诸多动物，但该菌感染加州鲈还未见报道。本研究通过对从患病加州鲈体内分离到的普通变形杆菌进行鉴定、人工感染及药物敏感性试验，以期为该病原引发的水产动物疾病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

患病死亡的加州鲈取自广东佛山市某养殖场，主要症状为体表有溃疡病灶，肝、肾脏轻度充血，肠道溃烂，健康的加州鲈（平均体质量114g）购于佛山某养殖场。

普通营养琼脂、普通营养肉汤、肠杆菌科细菌生化常规鉴定盒均购于广东环凯微生物科技有限公司。药敏纸片购于杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化

按无菌操作步骤，从病鱼的肝、肾分离病原菌，在普通营养琼脂上划线，37℃培养48h，挑取2 株优势菌落（201901141 和201901142）进行纯化培养，分别接种到营养肉汤，37℃振荡培养18h，纯化后的细菌加入无菌甘油，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 生理生化试验

将菌株201901141 和201901142 的新鲜菌液分别接种于生化管，按说明书对葡萄糖（产酸产气）、乳糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、纤维二糖、山梨醇、卫茅醇、肌醇、甘露醇、水杨素、七叶苷、葡萄糖磷酸盐胨水（MR）、葡萄糖磷酸盐胨水（VP）、西蒙氏柠檬酸盐、硫化氢、尿素、半固体琼脂（动力）、β-半乳糖苷、硝酸盐还原进行检测。

1.2.3 16S rRNA 基因的扩增与序列分析

选用细菌16S rRNA 基因通用引物（正向：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向：5’-TACG GCTACCTTGTTACGACTT-3’），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。50μL 的PCR 反应体系中含有：5μL 10×PCR 缓冲液（含Mg2+），4μL 10mmol/L 4×dNTP，各1μL 10mmol/L 正向和反向引物,1μL Taq DNA 聚合酶（1U/μL），1μL 模板，37μL ddH2O。PCR 反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行30 个循环，最后72℃延伸10min，4℃保温。扩增产物经电泳检测后,送至生工生物工程（上海）股份有限公司广州测序部纯化后测序。将测序结果与GenBank 中的核酸序列进行BLAST 分析,应用MEGA 4.1 软件进行同源性分析，构建系统进化树。

1.2.4 人工感染

将菌株201901141 和201901142 分别接种到营养肉汤中，37℃振荡培养18h，用无菌生理盐水将菌液依次稀释至浓度为2.57×104CFU/mL、2.57×105CFU/mL、2.57×106CFU/mL、2.57×107CFU/mL、2.57×108CFU/mL 和2.57×109CFU/mL。以上各浓度的菌液,以0.3mL/尾的剂量分别腹腔注射10 尾，作为感染组；以腹腔注射同剂量无菌生理盐水为对照组。接种后观察鱼的发病、死亡情况，解剖发病死亡的鱼，再进行细菌分离鉴定。根据改进的寇式法[12]计算半致死剂量。

1.2.5 药敏试验

药敏试验采用琼脂扩散法。分别用无菌生理盐水稀释201901141 和201901142 的新鲜菌液，取100μL 菌液到普通营养琼脂平板上均匀涂布，用无菌镊子将药敏纸片平铺在上面，每种药片设3 个重复，于37℃培养48h 后，测量抑菌圈直径。根据“美国临床实验室标准化研究所（CLSI）抗菌药物敏感性试验执行标准（CLSI-M100-S19）[13]”判定该菌对抗生素药物的敏感程度。

2 结果与分析

2.1 病原菌感染实验

人工感染后，加州鲈的发病症状与自然发病的鱼相似，肝脏充血、肠道溃烂，从发病死亡鱼体内可再次分离到与原菌株形态相同的菌落，经鉴定证实为原感染细菌，表明菌株201901141 和201901142即为该病的病原菌。经计算，菌株201901141 和201901142 对健康加州鲈的半致死剂量分别为5.13×105CFU/g 和6.46×105CFU/g（表1）。

2.2 形态特征

分离菌在营养琼脂平板上37℃培养48h 后,菌落为灰白色，表面光滑，半透明，形成不规则的湿润薄膜状菌苔。在肉汤37℃振荡培养18h，菌液均匀浑浊，底部略有沉淀。

2.3 生理生化特性

生理生化试验结果（表2）显示：2 株菌能发酵葡萄糖产酸产气,发酵麦芽糖、蔗糖、木糖，不发酵乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、甘露糖和纤维二糖，能分解尿素，还原硝酸盐，利用西蒙氏柠檬酸盐，MR、硫化氢、动力试验显阳性，VP、山梨醇、七叶苷、卫茅醇、水杨素、肌醇、β-半乳糖苷试验显阴性。将生化试验结果与《伯杰细菌鉴定手册》[14]比对，菌株201901141和201901142 的生理生化特性均符合普通变形杆菌的特性。

2.4 16S rRNA 基因序列分析

将测序得到的菌株201901141 和201901142的16S rRNA 基因序列（MN491930 和MN490046）分别在GenBank 中进行BLAST 分析,显示与普通变形杆菌的同源性分别为100%和99.86%。根据上述序列构建系统发育树，菌株201901141 和201901142 与普通变形杆菌（KT794006）聚为一支（图1），结合形态和生理生化特性，证实为普通变形杆菌。

2.5 体外药敏试验

药敏试验结果显示，普通变形杆菌201901141和201901142 均对头孢曲松、头孢他啶、哌拉西林、氟苯尼考、四环素、米诺环素、奥复星、卡那霉素、庆大霉素、淋必治和丁胺卡那高度敏感；对羧苄西林、氨苄西林-舒巴坦、新霉素中度敏感；对头孢唑啉、头孢呋辛、先锋霉素Ⅴ、氨苄西林、苯唑西林、阿奇霉素、多粘菌素B、洁霉素、克林霉素不敏感（表3）。

表1 病原菌株201901141 和201901142 感染实验结果Tab.1 Infection test results of strains of bacterial pathogen 201901141 and 201901142

表2 菌株201901141 和201901142 的生理生化特征Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strains 201901141 and 201901142

表3 药物敏感性实验结果Tab.3 The results of the drug sensitivity test

3 讨论

普通变形杆菌属于肠杆菌科变形杆菌属Proteus，是一种革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无荚膜，广泛存在于水、土壤、腐败的有机物以及人和动物的肠道中，有明显的多形性，在固体培养基上常呈扩散生长[15]。目前普遍认为，16S rRNA 基因的同源性大于97.5%的细菌菌株可视为同种，而同属的16S rRNA 基因的同源性应大于或等于90%[16]。菌株201901141 和201901142 的16S rRNA 基因序列经BLAST 比对后，与普通变形杆菌的同源性分别为100%和99.86%，均高于97.5%，且与普通变形杆菌以100%的置信度聚为一支。综合形态学观察、生化鉴定、16S rRNA 基因序列分析,鉴定分离菌为普通变形杆菌。人工感染表明：两株菌的半致死剂量分别为5.13×105CFU/g 和6.46×105CFU/g，表现出很强的致病力。再次从鱼体肝、肾脏分离的优势菌株普通变形杆菌也为本次引发加州鲈疾病的病原。送检病鱼和回归感染的加州鲈身体均出现溃烂现象，肝、肾脏充血，这与普通变形杆菌感染大口鲶[8]和斑点叉尾[11]的症状基本相同。变形杆菌通过菌毛黏附在宿主细胞上，快速滋生鞭毛和多糖荚膜,在宿主细胞内释放大量溶血素、尿素酶、溶蛋白酶等毒力因子,使宿主发病[11]。已报道的危害加州鲈的病原细菌主要有洋葱霍尔德氏菌Burkhol cepacid[17]、维氏气单胞菌Aeromonas veronii[18]、温和气单胞菌A.sobria[19]、迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda[20]、白皮极毛杆菌Pseudomonas dermoalba、柱状纤维粘细菌Cytophaga columnaris、诺卡氏菌Nocardia seriolae、嗜水气单胞菌A.hydrophila、柱状黄杆菌Flavobacterium columnare[21,22]，而变形杆菌属感染加州鲈致病的报道极少，目前仅夏理海等[23]报道变形杆菌、维氏气单胞菌和虹彩病毒Megalocytivirus 共同感染加州鲈，普通变形杆菌单独引发加州鲈疾病尚属首次。普通变形杆菌是人畜鱼共患重要病原之一，虽是条件致病菌，但在高密度、大规模养殖模式下，也容易引发大规模病害[24]。普通变形杆菌作为一种食源性的条件致病菌广泛存在于自然界，要避免其危害水产动物，就要从食物端做好管理，切断传播途径。

目前，防控鱼类细菌病害的主要手段还是使用抗生素[25]。抗生素药敏试验表明：两株菌对四环素类、氨基酸糖苷类、氯霉素类、氟喹诺酮类药物高度敏感，对β-内酰胺类、大环内酯类、脂肽类、林可酰胺类药物不敏感；对头孢类和青霉素类部分药物敏感。两菌株对庆大霉素、卡那霉素和氟苯尼考敏感，对克林霉素、苯唑西林耐受，这与杨移斌等[11]和曹海军等[8]的研究一致；对四环素敏感，这与李槿年等[6]的结果不一致，可能是不同地区和水环境以及各地区用药不同所致[26]。虽然与中华鳖[6]、大口鲇[8]、斑点叉尾[11]这些水产动物分离到的普通变形杆菌耐药情况不尽相同，但本次实验所用大部分抗生素对加州鲈源普通变形杆菌还较为敏感，适当使用抗生素治疗，可减少经济损失。本研究中的药敏试验结果可为防治加州鲈普通变形杆菌病时合理用药提供参考。