纤维分解酶对大麦秸秆体外发酵和消化的影响

王先桂，许华杰，曾 丹

（1.茅台学院，贵州仁怀 564501；2.贵州珍酒酿酒有限公司，贵州遵义 563000）

反刍动物瘤胃中纤维素分解微生物负责消化植物纤维，这些微生物对纤维降解至关重要。Gado等（2009）研究表明，外源性纤维分解酶的添加可以促进微生物生长和微生物蛋白的合成。Morgavi等（2004）报道，木霉中纤维分解酶促进丝孢杆菌S85对玉米青贮和紫花苜蓿干草的粘附和降解，但未促进纯纤维素的降解。将纤维分解酶应用于青贮饲料时，它促进了需氧微生物的活性，并对瘤胃微生物氮掺入产生不利影响（Wang等，2002）。这些结果表明，纤维分解酶在使用前的预处理（水解）可能在调节纤维分解酶的功效方面发挥作用。反刍动物纤维分解酶产品比较广泛，但它们对养分利用的影响并不一致。因此，本研究旨在检验体外培养条件下外源纤维素酶对瘤胃纤维素分解菌生长的影响，并评估纤维酶预处理对其整体效果的影响。

1 材料与方法

1.1 试验1 以大麦秸秆和苜蓿干草为试验原料，采用产琥铂酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌对其进行体外消化试验。将20捆大麦秸秆和紫花苜蓿干草（每个5 kg）粉碎后过2.0 mm筛网，然后用1.5 mm的筛网收集1.5～2.0 mm的颗粒。试验用的酶主要以木聚糖酶和β-葡聚糖酶为主，浓度分别为0、30和300 μg/mL，之后参考Wang等（2003）的方法对样品进行处理，并评估原料中性洗涤纤维降解情况。

1.2 试验2 大麦秸秆样品的处理方法同试验1，试验共分为6个处理，对照组不经纤维素酶处理，T1组经过纤维素酶处理（150 mg/mL，7.5 mg），T2组纤维素酶处理，体外孵化前预先水解24 h，T3组T2组预处理后用水去除可溶性水解产物，T4组、T3组处理后再经过高压蒸汽处理，T5组在T3组的基础上加入与T2组同水平的还原糖。除T2和T3组外，其余12种底物均在批量培养前处理。选择2头带有瘤胃插管的公牛作瘤胃液体供体。在饲喂后2 h收集瘤胃液，通过4层纱布过滤。瘤胃液与缓冲液按1∶2的比例混合，将（15NH4）2SO4（0.75 g/L）作为微生物氮标记物加入缓冲瘤胃液中。孵育和测定干物质降解和挥发性脂肪酸含量的方法参考Wang等（2002）的研究。

1.3 统计分析 试验数据采用SAS软件多因素方差分析模型，在试验1中采用多项式检验酶浓度对指标的线性效应，组间差异用Tukey法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 外源酶及不同微生物孵育对苜蓿草和大麦秸秆中性洗涤纤维降解的影响 由表1显示，随着酶浓度的增加，中性洗涤纤维的降解率表现为显著线性升高（P＜0.05）。微生物种类对大麦秸秆中性洗涤纤维降解率的影响无显著差异（P＞0.05），但黄色瘤胃球菌对苜蓿草的消化能力显著高于产琥铂酸丝状杆菌（P＜0.05）。产琥铂酸丝状杆菌和酶浓度在300 μg/mL时对中性洗涤纤维的降解率具有显著协同效应（P＜0.05）。300 μg/mL酶浓度时，黄色瘤胃球菌对苜蓿草的消化表现最高（P＜0.05）。

表1 木聚糖酶、β-葡聚糖酶及微生物孵育对苜蓿草和大麦秸秆中性洗涤纤维降解的影响

2.2 纤维酶的预处理对大麦秸秆体外发酵气体产生和干物质降解的影响 由表2可知，与对照组相比，应用外源纤维素酶处理天然大麦秸秆可显著提高4 h气体产量及4、12和48 h干物质降解（P＜0.05），而外源纤维素酶应用于氨化大麦秸秆显著提高了4和12 h气体产量和干物质降解（P＜0.05）。与对照组相比，纤维素酶预先水解后显著提高了天然和氨化大麦秸秆4和12 h气体产生及4、12和48 h干物质降解（P＜0.05）。与T3组相比，T5组显著提高了4和12 h大麦秸秆气体产生（P＜0.05），同时提高了各孵育时间干物质降解（P＜0.05）。无论大麦秸秆类型是什么，T3、T4和T5组在各孵育时间的干物质降解均显著低于对照组（P＜0.05）。

表2 纤维素酶的预处理对大麦秸秆（天然或氨化）体外发酵气体产生和干物质降解的影响

2.3 纤维酶的预处理对大麦秸秆体外标记物残留量的影响 由表3可知，T1组较对照组显著提高天然秸秆中15N残留量（P＜0.05），而T3和T4组较对照组显著降低了15N残留量（P＜0.05）。T2、T3和T5组氨化大麦秸秆在孵育4 h后15N残留量显著提高（P＜0.05），而T1和T5组在孵育12 h后15N残留量显著提高（P＜0.05），所有处理组较对照组在孵育48 h后15N残留量均显著提高（P ＜ 0.05）。

2.4 纤维酶的预处理对大麦秸秆体外发酵挥发性脂肪酸含量的影响 由表4可知，与对照组相比，T3、T4和T5组天然大麦秸秆在孵育12和48 h后乙酸浓度显著降低（P＜0.05），而孵育48 h后的丙酸及4和12 h后的丁酸含量显著升高（P＜0.05）。氨化秸秆在孵育12和48 h后，处理组乙酸浓度显著低于对照组（P＜0.05），但丙酸浓度显著高于对照组（P＜0.05）。

表3 外源纤维素酶的不同预处理方法对大麦秸秆（天然或氨化）15N残留量的影响

表4 纤维素酶的预处理对大麦秸秆（天然或氨化）体外发酵挥发性脂肪酸含量的影响

3 讨论

有研究表明，黄色瘤胃球菌菌株具有降解植物细胞壁非纤维素多糖成分的能力，因为它们产生多种多糖酶，包括木聚糖酶和果胶酶（Erfle和Teather，1991）。这种能力可以解释本研究结果中黄色瘤胃球菌较产琥铂酸丝状杆菌能降解更多的苜蓿草，此外作者认为，这两种细菌降解中性洗涤纤维的能力取决于底物类型和外源纤维素酶水平。本研究表明，高压蒸汽灭活的外源纤维素酶对大麦秸秆的干物质降解无显著影响。外源纤维素酶对纤维素分解菌消化能力影响程度的差异可能是由于底物物理和化学特性、菌株固有酶谱和外源纤维素酶产物的酶谱有关（Morgavi等，2004）。

与紫花苜蓿干草相比，大麦秸秆含有较多的纤维素、半纤维素和木质素。Bhat等（1990）研究发现，黄色瘤胃球菌和产琥铂酸丝状杆菌在大麦秸秆上具有不同的粘附位点。本研究中使用外源纤维酶使产琥铂酸丝状杆菌较黄色瘤胃球菌增强了对大麦秸秆的降解能量，这表明外源纤维素酶谱与产琥珀酸丝状杆菌基因酶谱在大麦秸秆消化过程中具有更强的互补性。Jalilvand等（2008）通过混合瘤胃细菌研究发现，与苜蓿干草和青贮玉米相比，外源纤维素酶更能促进小麦秸秆等高纤维粗饲料的消化。但Gallardo等（2010）研究发现，外源纤维素酶对苜蓿干草消化的影响大于水稻秸秆。这些研究之间的差异可能是由于外源纤维素酶产物中酶种类和活性不同。

外源纤维素酶预处理（T2组）在孵育4 h后较T1组降低了15N残留量，这表明外源纤维素酶在瘤胃发酵前水解降低了初始细菌定殖。Wang等（2004）发现，经外源纤维素酶处理的大麦秸秆中酚类化合物较为集中。与对照组和T1组相比，外源纤维素酶水解后去除可溶性产物和纤维素酶底物的T3组15N残留量较低，这也说明外源纤维酶使大麦秸秆表面提高，进而减慢了细菌附着速度。本研究发现，尽管外源纤维素酶处理对大麦秸秆发酵产生的挥发性脂肪酸无显著影响，但经过水解预处理的外源纤维素酶组乙酸和丙酸比值较对照组降低，造成这一结果的原因还有待进一步研究。

4 结论

外源纤维分解酶可改善瘤胃细菌对纤维的消化能力，但其有效性取决于底物、细菌种类和孵育时间。在瘤胃孵育前将纤维素酶进行预水解可以通过增加还原性糖的有效性来促进微生物生长。