动脉粥样硬化生物学标志物生物信息学技术分析

(青岛大学附属烟台毓璜顶医院心内科，山东 烟台 264000)

动脉粥样硬化(AS)是由于动脉的变窄限制了富氧血液流向身体各个部位，从而引发AS相关临床表现的疾病。AS与血管壁的炎症过程、较高的低密度脂蛋白(LDL)水平具有相关性[1]，但导致该疾病的分子机制仍不清楚。AS的风险因素有很多，如胆固醇异常、高血压、糖尿病、吸烟、肥胖、家族史和不健康的饮食等。传统的危险因素，如高血压、糖尿病等，在预测AS方面有一定作用[2]，但不能完全预测AS风险，因此寻找更敏感的生物标志物，是当前研究急需解决的问题。寻找生物标志物有助于阐明疾病的分子机制，为疾病发生发展的预测提供更精确的证据。随着基因测序及芯片技术的发展和成本不断降低，生物信息学技术被广泛用于分析疾病的基因组层面的变化，这些技术有助于识别芯片数据涉及的差异表达基因和功能通路。虽然不同厂商的芯片数据差异较大，但不同研究间还是可能具有共同的差异表达基因。因此，本研究下载并分析了来自美国国家生物技术信息中心(NCBI)GEO数据库的2个芯片数据集，以获得AS组织和非AS组织的差异表达基因，寻找AS发生发展相关的潜在生物学标志物。

1 资料和方法

1.1 数据来源

以“atherosclerosis”作为关键词，在NCBI的GEO数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中检索已公布的AS的基因芯片数据集，获取分别于2013年4月和2011年4月发表的两个基因表达数据集GSE43292和GSE28829。GSE43292数据集来源于里昂第一大学和北奥斯陆大学，采用Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array平台，含有32个AS样本和32个正常样本的表达矩阵；该数据集选择的是爱德华·赫里欧医院的32例患有AS的病人，男女比例为29∶5，平均年龄为(70±10)岁，患有慢性肾脏疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和正在进行类固醇或其他免疫抑制药物治疗的病人均被排除在外。GSE28829来源于马斯特里赫特大学，采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平台，含有14个AS样本和14个正常样本的表达矩阵；该数据集选择的是慕尼黑伊利诺伊州立医院的尸体和血管外科手术切除的颈动脉组织。

1.2 差异表达基因筛选及可视化

采用R语言的limma包进行基因的差异表达分析，差异表达基因的筛选条件为差异倍数log fold change>1.5、adjust<0.05；应用R语言的plot数据包进行画图与展示。

1.3 差异表达基因的功能富集分析

使用DAVID在线数据库进行GO基因功能分析[3]，并用KEGG数据库进行差异表达基因的通路分析。以P<0.05为具有统计学差异的标准筛选基因并进行可视化展示。

1.4 蛋白相互作用网络分析

本研究使用STRING数据库(http://string-db.org)(版本10.0)进行蛋白相互作用网络分析，构建差异表达基因的蛋白相互作用网络，选择综合分数大于0.4的主要蛋白相互作用网络，将得到的蛋白相互作用网络导入Cytoscape软件中进一步分析。Cytoscape(3.4.0版)是一个开源生物信息学软件平台，用于可视化分子交互网络。使用Cytoscape软件绘制蛋白相互作用网络，并使用MCODE模块以MCODE scores>5、degree cut-off=2、node score cut-off=0.2、Max depth=100、k-score=2为标准确定网络中重要的区域，并进行画图。

1.5 关键基因筛选

对上述网络进行画图得到可能与AS相关的基因。为了验证所得到的基因是否与AS有关，通过检索文献获得研究支持。

2 结 果

2.1 原始数据的标准化

进行差异分析之前，为避免原始的基因矩阵中出现缺失值、基因对应多个探针等情况，应用R语言的limma包中normalize Between Arrays函数进行数据的标准化，随后进行可视化。经标准化处理后两个芯片数据集的数据分布效果较好(图1)，可以进行下一步差异分析。

2.2 标准化数据的聚类分析

使用R语言对标准化的GSE43292、GSE28829数据集进行聚类分析并绘制热图(图2)。结果表明，GSE43292、GSE28829数据集中发现了聚类的现象，提示在样本中出现了某些基因的富集。

2.3 差异表达基因的筛选

GSE43292数据集经筛选后得到1 086个基因，其中上调基因462个，下调基因624个；GSE28829数据集经筛选后得到1 733个基因，其中上调基因1 024个，下调基因709个。基因筛选后制作火山图进行可视化，见图3。

2.4 差异表达基因的功能分析及通路分析

数据集GSE28829的富集分析表明，差异表达基因的细胞组分变化主要富集在细胞表面、血浆膜外侧、细胞外体、细胞外区域、细胞基质等，生物学过程主要富集在免疫球蛋白受体结合、免疫反应、炎症反应等。GSE43292的富集分析表明，差异表达基因的细胞组分变化主要富集于细胞外区域、细胞外基质、细胞基质等，生物学过程主要富集在cAMP信号通路、细胞黏附通路、环状体强化和色氨酸代谢通路等。见图4。

2.5 差异表达基因的蛋白相互作用网络分析

本研究得到可能导致AS的潜在关键基因共24个：MMP9、ACP5、SPP1、FABP4、CD84、ITGB2、CHI3L1、FCGR2B、KYNU、SLAMF8、CXCL2、CXCR4、CCL18、CCL19、PL2B、TNFSF13B、APOE、MS4A4A、TIMP1、SERPINA1、IGLL5、IGL5、IGJ、TFE3、IGLL5。进行相关文献检索结果显示，MMP9、FABP4、CXCR4基因与AS相关。见图5。

A为GSE43292差异表达基因的KEGG通路分析饼图；B为GSE43292差异表达基因的功能富集分析条形图；C为GSE28829差异表达基因的功能富集分析条形图；D为GSE28829差异表达基因的KEGG通路分析饼图。

图4 差异表达基因的功能分析和通路分析

3 讨 论

AS的主要病因因素有很多，包括血液中较高水平的胆固醇和LDL、血液中低水平的高密度脂蛋白(HDL)、高血压、烟草烟雾、糖尿病、肥胖、不健康的生活方式、家族心脏病史等。然而，该疾病的分子机制仍然没有被阐明。随着分子生物学发展和成本降低，基因分析、精准治疗成为新的诊断及治疗手段。本研究使用R语言对GSE43292和GSE28829数据集进行聚类分析并绘制热图，结果表明，在这两个数据集中发现了差异表达基因聚类的现象。通过功能富集及通路分析探索差异表达基因的功能注释信息，并使用R语言绘制功能分析及通路分析的条形图，结果显示，差异表达基因细胞组分主要集中在血浆膜外侧、细胞基质等，生物学过程主要富集在cAMP信号通路、细胞黏附通路等。再通过构建蛋白相互作用网络筛选出了24个关键基因，经文献检索显示，其中的MMP9、FABP4、CXCR4基因与AS相关。

3.1 MMP9基因与AS相关性

纤维帽的细胞外基质成分与冠状动脉AS斑块的稳定性有关，其厚度与斑块的稳定性呈正相关。MMPs是一种蛋白酶系，其作用可加速纤维帽细胞外基质分解，进而导致斑块破裂。MMPs可降解很多细胞外基质，如胶原、弹性蛋白、纤维连接蛋白等。MMP9是MMPs中的一种明胶酶，它可以分解粥样斑块和纤维帽中内皮基底膜的Ⅳ型胶原，增加斑块的不稳定性，进而引发斑块的破裂[4]。本研究结果表明，MMP9基因与AS的不稳定性相关。提示MMP9可能是AS的潜在生物标志物。

已有实验研究验证了MMP9和AS斑块破裂的相关性[5]。有研究表明，高脂肪摄入的动物相较于低脂肪摄入组具有更高水平的MMP9表达[6]。也有研究应用网络药理学方法预测一种治疗高脂血症的传统中药的作用靶基因可能为MMP9[7]。

3.2 FABP4基因与AS相关性

脂肪酸结合蛋白(FABPs)是游离脂肪酸的伴侣蛋白，可与胆固醇、花生四烯酸可逆性结合。该蛋白主要表达在脂肪和巨噬细胞中，参与脂肪酸的转运及脂肪分解，促进三酰甘油在脂肪细胞中的沉积，参与AS的病程。有研究显示，FABP4通过作用于脂蛋白酯酶，使血浆游离脂肪酸水平升高，而血浆游离脂肪酸水平升高又可以导致高三酰甘油血症的形成，进而参与斑块进展；在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞形成泡沫细胞的过程中，FABP4基因表达上调，加速了泡沫细胞中胆固醇和三酰甘油的积累，从而参与斑块的进展[8]。另有研究结果显示，FABP4在代谢综合征的冠心病病人中表达升高，并且其表达与冠状动脉AS程度和表皮脂肪组织体积有相关性[9]。也有研究显示，FABP4可以成为AS的独立预测标志物[10]。有回顾性分析研究显示，血清FABP4水平与外周血管疾病的不良心血管事件具有相关性[11]。有成年小鼠的基因测序研究显示，心脏内皮细胞中FABP4的表达更高，FABP4可能成为未来AS的重要靶基因标志物[12]。

3.3 CXCR4基因与AS相关性

CXCR是基质细胞衍生因子-1的受体，参与内皮损伤、修复过程。业已证实，内皮细胞的损伤诱发的细胞黏附、血小板聚集等过程，参与了AS过程的开启。CXCR4可介导平滑肌细胞向损伤区域的动员，促进损伤区域血管内膜的增生，进而参与内膜的修复过程。有研究表明，内皮细胞中CXCR4的缺失，可降低细胞的增殖，进而影响创面的愈合，加速巨噬细胞浸润，从而导致AS过程的进展[13]。此外，有实验研究表明，小鼠CXCR4的敲除或抑制阻断了CXCL12对TCF21和ABCA1表达的影响，以及GSK3β和β-catenin的磷酸化，而小鼠中过度表达CXCL12可扩大AS病变区域，可能导致AS斑块中巨噬细胞的渗透[14]。

有研究表明，使用新型CXCR4定向正电子发射断层扫描示踪剂，相较于传统的正电子发射断层扫描示踪剂能够检测出更多的AS斑块[15-16]。另有研究表明，CXCR4在B-1细胞中的表达与血浆中针对malondialdehyde-modified LDL的IgM抗体呈正相关，与冠状动脉斑块的程度呈负相关[17]。有基因研究显示，BPIFB4可能调节CXCR4，参与小鼠AS和炎症进展，这为未来的基因治疗AS提供了可能[18]。有研究显示，CXCL12与CXCR4结合可能是AS的新治疗靶点[19]。也有研究显示，亚临床心血管疾病病人CXCR4表达降低，提示CXCR4可能是亚临床心血管疾病的保护基因[20]。

综上所述，本研究共确定了24个关键基因，其中文献支持MMP9、CXCR4和FABP4基因与AS相关，它们可能是AS的生物标志物。除MMP9、FABP4和CXCR4外，其他的21个基因在本研究中差异同样具有统计学意义，也可能与AS相关，但需要进一步的研究来阐明这些基因与AS发生发展的相关性。本研究结果可为AS的分子诊断和治疗开发提供算法预测和数据分析支持。