冬凌草甲素对大鼠脑出血后继发性脑损伤的保护机制

熊静,卢冬林2,王梓炫,邢昂

(青岛大学附属医院,山东 青岛 266100 1 老年医学科； 2 神经外科)

脑出血(ICH)是第二常见的脑卒中类型，致死率和致残率高[1-2]。迄今为止，ICH治疗干预的重点是早期预防血肿扩张，包括止血和抗高血压疗法，但并不能够有效减少血肿的扩张以及改善预后[3]。ICH分为原发和继发性损伤，脑血管外渗的血液在实质中形成血肿，使局部压力增大，导致原发性脑损伤，随后血肿降解又会引起细胞损伤、氧化应激和炎症反应，进而出现细胞死亡、脑水肿和神经行为缺陷等，导致继发性损伤[4]。越来越多研究表明，血肿形成后炎症反应和氧化应激与ICH诱发的继发性脑损伤和神经功能障碍密切相关，针对治疗脑血肿和ICH相关药物研发一直以来都是研究的热点[5-6]。冬凌草甲素(Ori)属于二萜类化合物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学作用[7-8]。有研究表明，Ori可减轻脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞的炎症反应[9]。Ori也可直接抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体以及核因子κB(NF-κB)炎症通路，减轻卡拉胶诱导的小鼠胸膜炎[10]。此外，Ori还可以激活Kelch样环氧氯丙烷相关联蛋白1(KEAP-1)/核转录相关因子2(Nrf2)信号通路的表达，从而发挥抗氧化的作用[10]。但是，Ori在ICH中的作用及机制尚不明确，故本研究对大鼠ICH模型进行Ori干预，观察不同剂量Ori对ICH大鼠神经功能、神经元变性、NF-κB及Nrf2/血红素加氧酶-1(HO-1)信号通路表达水平的影响，以探讨Ori在ICH中的作用及其可能的机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠150只，体质量250～280 g，购自北京维通利华实验动物公司。每笼6只群养于青岛大学医学部动物中心大鼠饲养室。饲养条件：环境清洁，温度及湿度舒适，12 h昼夜交替，自由饮水和摄入食物。该动物实验获青岛大学附属医院医学伦理委员会同意。

1.1.2药品和试剂 Ori购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(货号：28957-04-2)；胶原酶和Fluoro Jade-C(FJC)染料购自美国Sigma公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；NF-κB抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；Nrf2、HO-1多克隆抗体购自美国Affinity公司。

1.2 实验方法

1.2.1动物分组及处理 将大鼠随机分为假手术组(Sham组，A组)、ICH组(B组)、溶剂组(ICH+Veh组，C组)、Ori低剂量组(ICH+LOri组，D组)、Ori中剂量组(ICH+MOri组，E组)、Ori高剂量组(ICH+HOri组，F组)。实验大鼠在实验前8 h禁止饮食。除Sham组外，其余5组大鼠使用胶原酶诱导建立ICH模型[11]。大鼠麻醉后固定在脑立体定向仪上，以前囟为原点，向右3.5 mm、向前0.2 mm作为穿刺点，进针深度5.5 mm，用10 μL微量注射泵以1 μL/min注入1 μL胶原酶Ⅳ(3 U)，留针10 min，缓慢退针，用骨蜡封闭其骨孔，消毒缝合切口，将大鼠置于笼中观察，待其麻醉复苏。待大鼠麻醉清醒，Ori低、中、高剂量组于术后2、24和48 h分别给予Ori 5、15、25 mg/kg的腹腔注射(由于Ori可透过血-脑脊液屏障，故本次药物注射的方式采用腹腔注射)，ICH+Veh组腹腔注射等体积的生理盐水。Sham组操作与ICH组相同，但不注射胶原酶。150只大鼠进行手术，其中114只手术成功，36只手术失败或死亡。

1.2.2神经行为学检测 手术或药物处理72 h后，每组取6只大鼠，使用改良神经功能缺损程度评分(mNSS)对大鼠的神经功能进行评定，包括提尾试验、行走试验、感觉试验、平衡木试验等。对这些项目进行综合评分，总分0～18分，评分越高，神经系统损害就越严重。

1.2.3脑含水量测定 神经功能评定后处死大鼠取全脑，去除嗅球和脑干，将其分为左脑、右脑、小脑等3部分，迅速称湿质量。然后将脑组织放到烘箱，在100 ℃温度下烘干24 h，称干质量。脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.2.4Western blot检测NF-κB、Nrf2和HO-1蛋白表达 在手术和药物处理72 h后，每组取6只大鼠，提取其脑组织置于-80 ℃冰箱里冷冻保存。取出冷冻的脑组织放在冰板上面，用刀片将ICH区域的脑组织分成5等份，取血肿周围组织提取蛋白质(后续实验取样的脑组织均为血肿周围组织)，用BCA法测量蛋白质的浓度，SDS-PAGE凝胶跑胶，每孔上样10 μg蛋白，电泳(80 V，30 min，再120 V跑到底)，转PVDF膜(250 mA，1.5 h)，应用体积分数0.05牛奶封闭1.5 h，加一抗4 ℃过夜，加二抗室温1.5 h，显影。

1.2.5ELISA检测TNF-α、IL-1β和IL-6表达 取Sham组、ICH组、ICH+Veh组和ICH+MOri组的大鼠脑组织，采用双抗体夹心ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。在酶标板中加100 μL标准品工作液或样本，37 ℃孵育90 min，弃液，加100 μL生物素化抗体工作液，37 ℃孵育60 min，洗板3次；每孔加入100 μL HRP酶结合物工作液，37 ℃孵育30 min，弃液，洗板5次；每孔加90 μL底物溶液，37 ℃孵育15 min，每孔加50 μL终止液，立即读取450 nm波长处的吸光度值。

1.2.6免疫荧光染色检测Nrf2、HO-1的表达 取Sham组、ICH+Veh组和ICH+MOri组的大鼠脑组织进行免疫荧光染色。首先用40 g/L的多聚甲醛灌注取脑，蔗糖梯度沉糖后，进行冷冻切片；固定、通透、封闭切片，加Nrf2、HO-1一抗4 ℃过夜，加荧光二抗室温1 h；用含DAPI的封片剂封片，萤光显微镜下观察阳性细胞数。

1.2.7FJC染色检测神经元损伤情况 取Sham组、ICH+Veh组和ICH+MOri组的大鼠脑组织进行FJC染色。脑组织冷冻切片室温复温30 min，用双蒸水浸泡2 min，50 ℃烘干30 min，置于含10 g/L NaOH的体积分数0.80乙醇中浸泡5 min，置于体积分数0.70乙醇中浸泡2 min，以双蒸水浸洗2 min；将切片放入0.6 g/L高锰酸钾溶液中反应10 min，用蒸馏水浸洗2 min；将切片放入FJC溶液中反应20 min，以双蒸水浸洗3次，每次2 min；再置50 ℃的烘箱中烘干，二甲苯透明2 min；最后用DPX封片液封片，在荧光显微镜下计数FJC阳性细胞并拍照。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 Ori对ICH大鼠神经功能评分的影响

手术或药物处理72 h后，Sham组、ICH组、ICH+Veh组、ICH±LOri组、ICH+MOri组和ICH+HOri组的mNSS评分分别为0.67±0.58、10.33±1.53、10.00±1.73、8.00±1.00、6.67±0.58和6.33±0.58(n=6)。与Sham组比较，ICH组和ICH+Veh组的mNSS评分明显升高(F=30.33，q=15.140、14.620，P<0.05)，而ICH组与ICH+Veh组比较差异无显著性(P>0.05)；与ICH组和ICH+Veh组相比，Ori处理各组mNSS评分均有下降，其中ICH+MOri组、ICH+HOri组的差异具有显著性(q=5.222～5.745，P<0.05)，而ICH+MOri组和ICH+HOri组mNSS评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组脑组织含水量比较

各组大鼠左半脑和小脑含水量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。ICH后大鼠右半脑含水量显著增加，经过中、高剂量Ori处理后，大鼠右半脑含水量显著降低(F=21.76，q=6.924～8.527，P<0.05)，而ICH+MOri组和ICH+HOri组间脑水肿减轻的程度差异无统计学意义(P>0.05)，ICH组与ICH+Veh组间相比较差异也无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 Ori对ICH大鼠脑组织中NF-κB、Nrf2以及HO-1表达的影响

ICH组和ICH+Veh组大鼠脑组织中NF-κB、Nrf2和HO-1的蛋白表达均较Sham组升高，经中、高剂量Ori处理后NF-κB表达降低，而Nrf2和HO-1的表达则进一步升高，差异均有统计学意义(F=15.17～61.18，q=6.303～10.110，P<0.05)；ICH+MOri组和ICH+HOri组间各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1、表2。

组别左半脑右半脑小脑A组78.68±0.7978.82±0.4878.73±0.54B组79.10±0.3181.83±0.7778.92±0.67C组79.21±0.5082.19±0.7679.06±0.31D组78.99±0.7881.18±0.8678.93±0.61E组79.04±0.3280.30±0.5578.83±0.77F组78.98±0.6879.86±0.4478.54±1.06

A：Sham组，B：ICH组，C：ICH+Veh组，D：ICH+LOri组，E：ICH+MOri组，F：ICH+HOri组。

图1 各组大鼠脑组织中NF-κB、Nrf2和HO-1蛋白的表达

2.4 Ori对ICH大鼠脑组织炎症因子表达的影响

综合上述神经行为学、脑含水量以及Western blot的检测结果，可知Ori在中、高剂量时均对ICH大鼠有神经保护作用，并且两组治疗效果无明显差别，因此Ori处理各组中仅选择ICH+MOri组进行后续实验。

ICH后脑组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达显著升高，在Ori处理后各指标的表达明显下降(F=24.53～69.26，q=6.208～17.120，P<0.05)。见表3。

组别NF-κBNrf2HO-1A组63.34±4.1263.28±9.5830.06±9.92B组93.10±3.35106.45±10.7176.40±5.12C组95.01±9.05106.97±5.8369.29±10.55D组85.12±2.67125.02±12.3591.34±8.80E组74.84±5.12144.88±4.14122.09±6.94F组72.78±6.38144.95±5.18125.90±4.07

组别TNF-αIL-1βIL-6A组94.87±17.3532.83±7.0439.81±16.71B组308.99±30.53100.72±11.13106.38±15.18C组306.13±22.20106.34±17.11116.13±5.16E组180.93±12.2761.76±10.1072.62±7.30

2.5 各组脑组织中Nrf2和HO-1的荧光表达比较

ICH后抗氧化蛋白Nrf2及其下游蛋白HO-1的表达均增加，经中剂量Ori处理后，ICH+MOri组Nrf2和HO-1的表达较ICH+Veh组明显增高，差异均具有统计学意义(F=347.30、61.14，q=4.780～18.880，P<0.05)。见图2、表4。

2.6 各组神经元损伤情况比较

与Sham组相比，ICH+Veh组血肿周围绿色荧光的数量明显增多(F=97.99，q=19.970，P<0.05)，而ICH+MOri组绿色荧光的数量较ICH+Veh组减少(q=13.180，P<0.05)。见图3、表4。

3 讨 论

ICH早期致死率、致残率都很高，目前还没有理想的治疗方法[12-13]。越来越多的证据表明，氧化应激和炎症在ICH后继发性脑损伤中发挥着重要作用[14-16]，这种继发过程会导致ICH后病人的神经功能恶化[17]。本文的研究结果显示，ICH+MOri组和ICH+HOri组大鼠的mNSS评分、FJC阳性神经元数量以及促炎因子表达均显著下降，表明15和25 mg/kg的Ori均能够改善ICH后早期脑损伤和神经功能缺陷，并且15 mg/kg为理想剂量。

小胶质细胞介导的炎症损伤在ICH中起至关重要的作用用[18-19]。ICH发生后，小胶质细胞中的NF-kB会被激活，进而使促炎因子的释放增加，导致早期脑损伤用[20]，而这些促炎因子又作为NF-κB的激活剂，正反馈促进NF-κB的转录，进而加重炎症反应[21]。NF-κB作为一个关键的核转录因子，一直被公认是炎症反应的关键调节器[22]，抑制NF-κB的活性可以减轻神经功能损伤[23]。已有多项研究表明，Ori在抗肿瘤、促凋亡、抗炎、抗氧化、神经调节等方面有着十分重要的作用[14-25]，但其在ICH中的作用尚未见报道。ZHAO等[26]的研究结果显示，Ori通过调节Toll样受体4(TLR4)/NF-κB信号通路抑制促炎因子的表达，在小鼠急性肺损伤中起保护作用。有研究表明，Ori能够抑制NF-κB通路和Aβ1-42诱导的神经炎症[27]。本研究也证实了Ori的抗炎作用，在大鼠ICH后，15 mg/kg的Ori能够抑制NF-κB的表达和促炎因子的释放，减轻ICH后脑内的炎症反应。

组别Nrf2HO-1FJC阳性神经元A组15.26±1.4324.41±2.87 1.33±1.53C组50.55±3.3036.49±5.40188.67±18.18E组84.92±4.3063.06±4.4977.67±17.47

此外，氧化应激是ICH后继发性脑损伤的重要原因[28]，Nrf2作为氧化应激反应中的关键转录因子和主要调节剂，在ICH后其表达逐渐增加，并诱导抗氧化基因的表达，在保护脑组织免受ICH后的氧化损伤中起重要作用[29]。研究已表明，Ori还可通过抑制NADPH氧化酶，促进KEAP-1与Nrf2解离，这样就会使Nrf2进入细胞核中转录并激活下游蛋白HO-1，在疾病中发挥抗氧化作用[10]。ZENG等[30]研究表明，异黄体生成素可以加快激活Nrf2介导的抗氧化信号通路从而减少对实验性ICH后的早期脑损伤。这与本研究结果类似，提示Ori可能通过促进Nrf2/HO-1抗氧化作用，减轻ICH大鼠的早期脑损伤，起到神经保护作用。

综上所述，Ori对ICH模型大鼠早期脑损伤具有一定的保护作用，其机制可能为Ori通过促进Nrf2/HO-1抗氧化作用以及抑制NF-κB介导的炎症通路，减少氧化应激和炎症细胞浸润，从而在ICH早期脑损伤中起到神经保护作用。