褐藻胶寡糖对D-半乳糖诱导小鼠骨质疏松的作用

(青岛大学附属医院老年医学科，山东 青岛 266100)

骨质疏松具有骨微观结构退行性改变、骨量减少和骨密度降低的特点，导致骨强度降低[1]、骨脆性增加[2]及骨折风险增加[3]，引起了老龄化社会的广泛关注。氧化应激学说是衰老的重要机制之一[4]，该学说认为活性氧(ROS)的积聚超过机体的清除能力造成DNA损伤、激活氧化应激，从而导致衰老及衰老相关疾病的发生。ROS在体内积聚可激活核因子κB受体活化因子配体(RANKL)信号通路，导致骨吸收增加。RANKL信号通路被认为是促进破骨细胞活化的主要靶点，可激活多种下游信号通路[5]，从而促进骨吸收和破骨细胞分化过程。长期注射D-半乳糖(D-gal)可导致实验动物产生一系列类似于自然老化的病理变化，如认知障碍、氧化应激和骨量减少等[6]。用D-gal诱导建立亚急性衰老模型具有周期短、价格低廉、操作简便、结果稳定可靠等优点，已广泛应用于衰老机制研究和抗衰老药物筛选。褐藻胶寡糖(AOS)具有较高的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤等[7]。骨质疏松性骨折是导致老年人死亡的主要原因之一[8]，因此骨质疏松症的早期预防、诊断和治疗十分重要，开发更有效的延缓骨质疏松症的药物具有重要意义。目前大多数骨质疏松研究侧重于绝经后妇女，而缺乏对老年男性骨质疏松的研究。故本实验采用D-gal诱导建立小鼠骨质疏松模型，探讨AOS对衰老雄性小鼠骨质疏松的作用及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

健康雄性C57BL/6J小鼠45只，SPF级，8周龄，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，饲养于青岛大学医学部SPF级实验动物中心。饲养条件：12 h昼夜循环，室温(20±2)℃，相对湿度40%～60%，自由摄食物和水。动物实验操作均经青岛大学动物福利和伦理管理委员会批准，并且遵守中国动物保护委员会制订的《动物保护与使用指南》。P16小鼠单克隆抗体购自美国 Cell Signaling Technology公司，RIPA裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司，逆转录试剂盒及Mix购自Roche公司。

1.2 实验方法

1.2.1动物分组及处理 45只小鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组(Control组，A组)、模型组(D-gal组，B组)、D-gal+AOS低剂量组(D-gal+AOS-L组，C组)、D-gal+AOS中剂量组(D-gal+AOS-M组，D组)以及D-gal+AOS高剂量组(D-gal+AOS-H组，E组)，每组9只。Control组小鼠颈背部皮下注射灭菌注射用水5 mL/(kg·d)，其余组小鼠颈背部皮下注射D-gal 200 mg/(kg·d)，连续8周。从D-gal注射第5周开始，AOS干预低、中、高剂量组分别给予AOS 50、100、150 mg/(kg·d)灌胃处理4周，Control组和D-gal组小鼠给予蒸馏水10 mL/(kg·d)灌胃处理4周。

1.2.2骨密度测量 药物干预完成后，取每组各3只小鼠的同侧股骨，采用双能X线骨密度仪(Dexa；Osteosys Primus，Korea)对整个股骨进行骨密度测量(扫描间距1.5 mm，扫描速度60 mm/s)。

1.2.3Western Blot检测P16和P67 phox蛋白表达 药物干预完成后，取每组各3只小鼠的股骨组织进行液氮研磨，将RIPA裂解液加入研磨好的股骨组织中提取蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度。提取的蛋白进行SDS-PAGE电泳，待溴酚蓝至分离胶底部时转移到PVDF膜上，凝胶成像系统成像后用Quantity One软件分析灰度值。

1.2.4RT-PCR检测股骨组织p47phox、gp91phox和RANKLmRNA的表达 药物干预完成后，取每组各3只小鼠的股骨组织进行液氮研磨，加Trizol 50～100 g/L，颠倒混匀室温放置30 min。4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，弃沉淀，加1/5体积氯仿，充分震荡混匀后置于冰上静置5 min。4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，将上清转移至新的1.5 mL EP管中。加入与上清等体积的异丙醇，充分震荡混匀，置于冰上静置10 min。4 ℃下以12 000 r/min离心10min，弃上清，加体积分数0.75的乙醇溶液悬浮沉淀。4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，吸除上清，自然晾干后加入10 μL DEPC水溶解RNA。用Nanodrop分光光度计测定RNA浓度，用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。应用RT-PCR法进行扩增，扩增条件：95 ℃、600 s，95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共计40个循环；95 ℃、10 s，65 ℃、60 s,97 ℃、1 s。PCR引物及其序列见表1。

1.3 统计学方法

表1 PCR引物及其序列

2 结 果

2.1 各组小鼠股骨骨密度比较

与Control组相比较，D-gal组小鼠股骨骨密度明显下降；与D-gal组相比较，AOS干预各组小鼠股骨骨密度明显增加，差异均有统计学意义(F=46.853，P<0.05)。见表2。

2.2 各组小鼠股骨组织中P16和P67 phox蛋白表达比较

与Control组相比较，D-gal组小鼠股骨组织中P16和P67 phox蛋白表达增加；与D-gal组比较，AOS干预各组小鼠股骨组织中P16和P67 phox蛋白表达降低，差异均有统计学意义(F=50.862、156.943，P<0.05)。见图1、表2。

A：Control组，B：D-gal组，C：D-gal+AOS-L组，D：D-gal+AOS-M组，E：D-gal+AOS-H组。

图1 各组小鼠股骨组织中P16和P67 phox蛋白表达的Wes-tern Blot检测

组别骨密度P16P67 phoxA组0.670±0.0101.000±0.0001.000±0.000B组0.423±0.0381.503±0.0921.917±0.081C组0.620±0.0101.415±0.0501.043±0.095D组0.677±0.0491.063±0.0130.753±0.071E组0.717±0.0150.567±0.0150.573±0.070

2.3 各组小鼠股骨组织中p47 phox、gp91 phox 和RANKL mRNA表达比较

与Control组相比较，D-gal组股骨组织中p47phox、gp91phox和RANKLmRNA表达增加；与D-gal组相比，AOS干预各组小鼠股骨组织中p47phox、gp91phox和RANKLmRNA表达降低，差异均有统计学意义(F=17.373～112.311，P<0.05)。见表3。

组别p47 phoxgp91 phoxRANKLA组1.000±0.0001.000±0.0001.000±0.000B组2.503±0.1401.804±0.0617.962±0.609C组1.643±0.0871.378±0.2764.135±1.225D组1.138±0.0951.183±0.1631.681±0.172E组0.804±0.1610.848±0.1111.092±0.075

3 讨 论

到2050年，65岁以上的老年人口将超过8亿。随着世界人口平均寿命的延长，衰老相关疾病如阿尔茨海默病[9]、骨质疏松[10]等的发病率和死亡率将明显增加，其造成的社会医疗负担也日益加重。骨质疏松症是一种与年龄相关的退行性疾病，严重影响人们的生活质量，导致老年人的死亡率增加。衰老可以引起骨皮质和骨小梁的矿化减少、孔隙度增加及骨密度降低等，导致骨质疏松和骨折的风险增加[11]。本文研究结果显示，D-gal组衰老性骨质疏松模型小鼠的股骨骨密度较Control组显著降低，而与D-gal组相比，AOS干预各组小鼠的股骨骨密度显著增加。说明AOS对D-gal诱导的骨质疏松有保护作用。P16作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子[12]，在衰老和抑制肿瘤生长过程中起重要作用。P16在大多数啮齿动物和人体组织中的表达随年龄增长而显著增加[13]。本文结果显示，P16蛋白在D-gal组股骨中的表达增加，而与D-gal组相比，AOS干预各组小鼠股骨中P16蛋白的表达降低，说明AOS延缓了D-gal诱导的衰老进程。

氧化应激可诱导DNA损伤和细胞衰老，而抑制衰老可能是治疗骨丢失的有效方法。氧化应激与许多年龄相关疾病(骨质疏松、心血管疾病和神经退行性疾病等)有关，它可以破坏骨骼系统中骨吸收和骨形成的动态平衡，使骨硬度和强度降低，在骨质疏松的发生和发展中起重要作用[14]。ROS的一个主要来源是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，它可促进氧化应激的发生。本研究结果显示，D-gal组股骨中NADPH氧化酶亚基p67phox、p47phox和gp91phox的mRNA表达增加，而与D-gal组相比，AOS干预各组股骨中NADPH氧化酶亚基mRNA表达减少。表明AOS对衰老性骨质疏松的保护作用可能与氧化应激的抑制有关。

随着年龄的增长，破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨生成之间失去平衡[15]，当骨吸收超过骨形成时出现骨代谢失衡，引起骨量降低从而导致骨质疏松的发生。RANKL在破骨细胞生成中发挥着重要的作用[16]，可以与核因子κB受体活化因子(RANK)结合激活信号通路，促进破骨细胞活化、分化和成熟等过程[17]。RANKL相关信号通路被认为是促进骨丢失和破骨细胞活化的主要靶点[18]。本研究结果显示，在衰老性骨质疏松D-gal组股骨中RANKLmRNA表达增加，而与D-gal组相比，AOS干预各组小鼠股骨中RANKLmRNA表达降低，说明AOS对衰老性骨质疏松的保护作用可能与RANKL通路抑制有关。

综上所述，AOS对D-gal诱导的C57BL/6J小鼠骨质疏松有保护作用，其机制可能与氧化应激和破骨细胞活化抑制有关，具体机制还需进一步研究。