关节软骨中整合素αvβ3表达与老年膝骨关节炎退变程度的相关性

周超 王刊石 赵磊

(江南大学附属医院(无锡三院)骨科，江苏 无锡 214041)

膝关节骨关节炎作为一种严重损伤膝关节功能的退行性疾病，多伴随有软骨下骨质增生，易发于中老年群体，通常表现为膝关节处疼痛难忍、上下楼梯吃力，严重者膝关节处会出现肿胀而无法行动，极大地影响患者生活质量〔1,2〕。整合素(ITG)属于细胞黏附分子家族的一种异二聚体跨膜蛋白，主要由α和β两个亚单位组成，其αv亚基与不同的β亚基结合后可作为玻连蛋白及纤连蛋白的受体，在细胞-细胞、细胞-基础信号转导过程中发挥双向作用，进而调控细胞分化、转移、黏附等进程〔3,4〕。既往研究发现，ITGα5β1在早期发育性髋关节发育不良动物模型中表达水平与髋臼软骨的退变程度显著相关〔5〕，ITGαvβ3作为与ITGα5β1功能相似的家族成员，其在骨性关节炎不同退变程度关节软骨中表达差异性的相关研究较少，因此本研究利用全膝关节置换术得到的不同退变程度关节软骨标本作为研究对象，来分析关节软骨中ITGαvβ3表达水平与老年膝骨关节炎退变程度的相关性。

1 材料与方法

1.1标本样本来源 回顾性分析江南大学附属医院(无锡三院)2016年1月至2018年12月收治的20例老年膝骨关节炎行全膝关节置换术患者，均符合中华医学会骨科分会2007年修订的膝骨关节炎诊断标准〔6〕。关节软骨标本来源于全膝关节置换中股骨内外踝负重面软骨，根据Outerbridge分级标准〔7〕利用锋利的手术刀选择不同退变程度的软骨标本71例，均分为3块，1块用中性甲醛固定进行苏木素-伊红(HE)染色观察，其余2份用液氮迅速冷冻后保存于-80℃超低温冰箱待测。

1.2主要试剂 ITGαv、ITGβ3、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-13引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒(购自赛默飞世尔科技公司)；兔抗人ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13、GAPDH抗体(购于Cell signaling technology)。

1.3标本分组 根据HE染色结果，参考Mankin评分标准将所有标本分为正常组、轻度退变组、中度退变组、重度退变组。正常组0分(5例)；轻度退变组1～6分(23例)；中度退变组7～9分(24例)；重度退变组10～14分(19例)。

1.4qRT-PCR检测 取软骨组织标本50 μg，按照总RNA提取试剂盒说明书上操作步骤提取总RNA，提取后用紫外分光光度计检验，OD值(A260/A280)=1.8～2.0，并用凝胶电泳检测RNA的完整性。按照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。反转录体系(10 μl)：2×miRNA反应混合液5 μl，0.1 % BSA 1 μl，miRNA PrimeScript® RT酶混合物1 μl，总RNA 0.5 μl，去RNA酶双蒸水(ddH2O)2.5 μl。反应条件设置：37℃ 60 min，85℃ 5 s，4℃ 30 min。PCR体系10 μl：SYBR®Prmix Ex Tap Ⅱ(2×)5 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，ROX荧光参比染料(50×)0.2 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 3 μl。具体操作见试剂盒说明书。PCR参数设置：50℃激活聚合酶5 min，95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火和延伸34 s，反应进行40个循环。每个样孔设置3个复孔。引物信息见表1。用2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.5Western印迹检测 取关节软骨标本200 μg，用蛋白裂解液提取总蛋白质，调整各组蛋白浓度一致后，经十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、电转膜至甲醛处理过预处理过的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，密封2 h，加入兔抗人ITGαvβ3(1∶500)、MMP-9(1∶500)、MMP-13(1∶500)、GAPDH抗体(1∶1 000)一抗4℃孵育过夜，TBST漂洗40 min，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，电化学发光(ECL)液将PVDF膜显色，暗室曝光到X线片上，采用Imaging System软件分析各组条带灰度值，以目标蛋白与内参积分吸光度值比值表示蛋白的相对表达水平。

1.6统计学方法 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1不同退变程度关节软骨中ITGαv、ITGβ3、MMP-9、MMP-13的mRNA相对表达水平 ITGαv、ITGβ3、MMP-9、MMP-13的表达水平在膝关节炎关节软骨中存在差异性表达，并且随着关节软骨退变程度增加其表达水平明显升高，组间相比有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2不同退变程度关节软骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表达水平 ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表达水平在膝关节炎关节软骨中存在差异性表达，并且随着关节软骨退变程度增加其表达水平明显升高，组间相比有统计学意义(P<0.05)。见表3，图1。

2.3ITGαvβ3蛋白表达与MMP-9、MMP-13蛋白表达水平相关性分析 ITGαvβ3蛋白表达水平与MMP-9、MMP-13蛋白表达水平呈显著正相关(P<0.001)；MMP-9蛋白表达水平与MMP-13蛋白表达水平呈显著正相关(P<0.001)。见图2。

表2 不同退变程度关节软骨中ITGαv、ITGβ3、MMP-9、MMP-13 mRNA相对表达情况

与正常组相比：1)P<0.05；与轻度退变组相比：2)P<0.05；与中度退变组相比：3)P<0.05；下表同

2.4ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表达水平与关节软骨退变程度相关性分析 ITGαvβ3、MMP-9及MMP-13蛋白表达水平均与关节软骨退变程度呈显著正相关(P<0.001)。见图3。

表3 不同退变程度关节软骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表达水平

1：正常组；2：轻度退变组；3：中度退变组；4：重度退变组图1 不同退变程度关节软骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表达

图2 ITGαvβ3蛋白表达与MMP-9、MMP-13蛋白表达水平相关性

横坐标1.正常，2.轻度退变，3.中度退变，4.重度退变图3 ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表达水平与关节软骨退变程度相关性

3 讨 论

骨关节炎作为人类较为常见的一种退行性疾病，在发病过程中可观察到相关组织结构上的显著变化，这些变化与力学、生物学、遗传基因、免疫、代谢等因素关系密切〔8〕。目前研究认为骨关节炎的发生发展是软骨细胞、细胞外基质及软骨下骨降解合成耦联失衡引起的〔9〕。ITG作为关节软骨表面的机械敏感受体，主要发挥着介导胞外信号向胞内信号转换的作用，当受到各种应力刺激后，能够通过抑制细胞外基质的降解、增加细胞外基质的合成、抑制软骨细胞凋亡等方式来介导关节软骨的修复作用〔10,11〕。有研究表明，在骨性关节炎软骨细胞中ITG的β1亚基及所有类型的α亚基均会被表达来参与多种形式的外界应力刺激〔12〕。本研究选用了膝骨关节炎行置换术后的关节软骨标本，并根据Outerbridge分级和HE染色结果分为了不同退变程度组别，对ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13的mRNA相对表达水平进行分析发现，和正常关节软骨相比，不同退变程度关节软骨中的ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13表达存在明显差异，并且退变程度越严重表达水平越高，ITGαvβ3在正常软骨细胞中受到应力刺激时与白细胞介素(IL)-4表面受体形成异源二聚体，并通过Junus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信号转导和转录活化蛋白(STAT)信号转导通路来发挥保护软骨的作用〔13〕，但是骨关节炎病理状态是则会在细胞外基质中降解的纤维蛋白碎片刺激下，激活蛋白激酶(PKC)和细胞外信号调节激酶(ERK)，来促进细胞外基质降解关键蛋白MMP-9、MMP-13合成增加，加重软骨细胞损伤，加速软骨退化〔14〕。对不同退变程度关节软骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表达水平的分析发现，与mRNA相对表达水平一致，软骨退变程度越严重中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表达水平越高。

ITGαvβ3作为骨桥蛋白(OPN)的主要受体，由于OPN分子内特异性及高度保守的RGD序列存在，能够和ITGαvβ3结合后，激活FAK/Src复合物及下游Ras-MAPK信号转导途径，改变细胞骨架还能够促进肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1、IL-6等炎性细胞因子水平表达，加重炎性反应，对软骨组织造成持续性伤害〔15〕。MMPs在调控细胞外基质代谢中发挥着重要的作用，是机体生理重建和病理破坏的主要基础因素之一，在骨性关节炎病理状态下，MMPs大量合成与MMP抑制剂(TIMP)间的平衡被打破，关节软骨的主要成分Ⅱ型胶原在MMP-13的作用下大量降解，胶原网被破坏，软骨细胞将暴露在炎性因子的攻击下，引起凋亡，最终引起软骨退行性损伤〔16,17〕。本次研究对ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表达水平之间的相关性分析发现ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13表达水平对于关节软骨的退变程度均有一定的诊断价值。

综上所述，ITG作为软骨细胞中重要的信号转导分子，在骨性关节炎中的相关研究是目前的热点方向之一，本研究的ITGαvβ3作为IGT众多亚型之一，与关节软骨的退变程度之间呈显著正相关，并且还与MMP-9和MMP-13之间也呈显著正相关，但ITGαvβ3参与骨性关节炎发生进展的具体作用机制仍不清楚，还需要进一步深入研究。