基于整合药理学平台探讨三七治疗冠心病心绞痛的分子机制

李晓辉 成光宇 崔俊峰 刘爱东

(1长春中医药大学，吉林 长春 130117；2长春中医药大学附属医院；3长春中医药大学附属第三临床医院)

冠心病心绞痛是指因冠状动脉供血不足，心肌急剧、短暂缺血缺氧所致的，以胸痛为主要特点的临床综合征。心绞痛常因于慢性心功能不全，导致心肌收缩力下降而致。如果患者长期处于心绞痛发病状态，亦会增加心肌负荷，推进病情进展，严重时危及生命〔1〕。在中医学中没有冠心病心绞痛的记载，但《灵枢·厥病》曰：“真心痛，手足青至节，心痛甚，旦发夕死，夕发旦死”，“厥心痛，与背相控，善瘛，如从后触其心……痛如以锥针刺其心……卧若徒居，心痛间，动作痛益甚”。从文字描述来看，“真心痛”“厥心痛”的临床表现已经非常接近现代医学的冠心病心绞痛的临床症状了。中医药在治疗疾病过程中，以辨证论治为原则，以病因病机为基础，对病变进行整体治疗，多层次、多环节、多靶点、多效应的干预病变，疗效和安全性都有卓越的表现。所以中医药尤其在治疗稳定型心绞痛方面具有较大的价值。三七首见于《本草纲目》，“主止血散血定痛，能治一切血病”。三七，又称山漆、金不换，性温，味甘、微苦，归肝、心、胃、大肠经。三七为传统活血化瘀第一圣药。《本草纲目拾遗》记载：“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药之最珍贵者”。现代研究发现三七可抗血小板聚集、溶栓，降低血压及减慢心率，还可降低心肌耗氧量和氧利用率等〔2〕。在《药食同源目录》中将三七归为保健食品。目前人们保健意识越来越强，随着心血管疾病发病率的增加，越来越多的人选择三七粉作为防治心血管疾病的保健食品食用。有研究指出三七具有抗心肌缺血、抑制心肌收缩力、抗心律失常等作用，还能较好缓解冠心病引起的心绞痛等症状〔3〕。本文通过中医药整合药理研究平台对三七治疗冠心病心绞痛的分子机制进行研究及分析，以揭示其新的研究方向。

1 数据来源与分析方法

1.1三七化学成分来源 在中医药整合药理学研究平台v2.0(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)“中药材数据库”，数据库依据2015年版《中国药典》共收录402味药材，输入“三七”即可生成三七的化学成分数据库。

1.2候选靶标预测 在TCMIP平台中“整合药理学分析工具”采取通过化学成分二维结构相似性搜索，即采用MACCS分子指纹特征提取方法和Tanimoto系数定义的相似度计量方法，针对中药化学成分和FDA上市药物进行相似性打分，从而获取高可信度(相似度>0.8)的中药候选靶标谱，并通过功能挖掘，为进一步阐释中药作用原理奠定基础。在平台“中药(含方剂)靶标预测及功能分析”版块输入中药材“三七”即可获得候选靶标谱预测信息；基于“DisGeNET”、“HPO”、“Drugbank数据库”、“TTD”等资源的“疾病相关分子库”中，以“angina pectoris”为疾病或症状进行检索，提取检索出来的所有治疗靶点。

1.3关联网络挖掘与分析 基于中药候选靶标与目标疾病基因之间相互作用信息，建立中药靶标和疾病基因网络图；网络通过hub节点连接，节点的大小直接反应关联度的强弱；以“节点连接度(degree)”的2倍中位数为卡值选取核心节点；根据满足条件的拓扑结构特征值，即满足“degree”、“紧密度(Closeness)”、“介度(Betweenness)”3个中位卡值的节点为中药干预疾病失衡网络的候选靶标；然后，通过对药物候选靶标参与的功能、通路进行富集，进一步挖掘中药缓解疾病关键环节的分子机制，构建“中药材-成分-核心靶标-通络”的多维关联网络图。

2 结 果

2.1三七含有的化学成分及靶标预测 三七共收集化学成分93个，药物靶标共有875个。其中主要的化学成分有三七皂苷R1、三七皂苷R2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参醇等；靶标涉及生物素代谢过程、三羧酸循环、心肌细胞动作电位时的膜去极化、磷脂酰胆碱生物合成过程、胆固醇生物合成过程、葡萄糖代谢过程、ATP合成耦合电子输运、脂质代谢过程的调节、线粒体电子传递等。

2.2三七候选靶标的功能及相关通路分析 TCMIP通过化学成分二维结构相似搜索，取高可信度>0.8的中药进行分析。三七可得到255个候选靶标，平台基于GO和KEGG数据库对这些靶标的功能和通路通过富集分析得到基因功能(表1)和代谢通路(表2)结果，根据P值显示前20个条目。三七的候选靶标具有的功能信息主要有γ氨基丁酸(GABA)-A受体活性、ATP结合、核受体活性、离子通道活性、血红素结合、铁离子结合、类固醇激素受体等。有研究发现三七中含有的人参皂苷Rg1、三七皂苷单体2A-1-1抑制血小板聚集，可能通过抑制血小板受体操纵性钙通道活性发挥作用〔4〕。Sawicki等〔5〕研究发现游离血红素的积累对缺血状态下的心脏功能是有害的，可加剧心力衰竭的发生，并指出减少心脏中的游离血红素可能是防止心力衰竭发展的新方法。此外，三七总皂苷还可通过降低抑制性神经递质GABA改善麻醉大鼠意识状态〔6〕。

三七富集得到的通路主要有核受体转录途径、胆汁酸盐循环利用、胶凝作用、内源性甾醇、PPARα激活基因表达等。其中PPARα作为核受体超家族的一类配体依赖的核转录因子，高表达于心脏、肝脏、血管平滑肌细胞及血管内皮细胞等，在心血管疾病中发挥着不可忽视的作用。

表1 三七候选靶标基因具有的功能

表2 三七候选靶标参与的通路信息

不仅抑制心肌肥厚，还影响心血管疾病期间的炎症、细胞增殖和凋亡〔7〕、血管生成及心肌缺血/再灌注损伤等〔8〕，从而发挥保护心脏的作用，降低心血管疾病的发生。诱导PPAR-α可以明显减弱心肌纤维化相关基因表达；还能保留心脏功能和心肌能量，从而改善压力负荷过重的心力衰竭〔9〕。亦有研究表明激活PPAR-α对细胞和系统脂质稳态具有积极作用〔10〕，降低游离脂肪酸(FFA)和三酰甘油(TG)积累〔11〕,减少冠心病发生的诱因。此外，还发现冠心病患者不能有效排泄胆汁酸会导致冠状动脉粥样硬化疾病的发展，胆汁酸排泄量亦与冠心病长期死亡率增加相关；并指出排泄胆固醇能力受损可能是冠心病发展的一个额外的独立危险因素〔12〕。可见三七可能通过PPARα激活基因表达、胆汁酸盐循环利用等途径干预心血管疾病。

2.3三七治疗冠心病心绞痛核心靶标网络分析 通过TCMIP平台的网络分析模块，构建三七潜在靶标与疾病靶标相互作用网络。根据条件及degree显示35个靶点(图1)，图中节点的大小与degree呈正比。疾病与药物共同靶点有1个为CYP27A1，与血红素结合、铁离子结合、氧化还原酶活性、甾醇代谢过程等有关。

2.4三七治疗冠心病心绞痛关键靶标互作富集和靶标通路富集分析 基于GO和KEGG数据库针对三七化学成分的靶标和冠心病心绞痛的核心靶标进行基因和通路分析，根据P值显示前20个条目。

绿色方框代表三七；深绿色长方形代表冠心病心绞痛；绿色圆圈代表药物靶标；红色圆圈代表疾病靶标；紫色圆圈代表共同靶标图1 三七治疗冠心病心绞痛的候选靶标网络

三七治疗冠心病心绞痛关键靶标基因功能(表3)包括磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶活性、蛋白激酶活性、酶结合、ATP结合及NADH脱氢酶活性等。其中NAD(P)H氧化酶是血管系统中活性氧(ROS)的主要来源，在缺血性损伤和AS形成中发挥重要作用〔13〕。三七治疗冠心病关键靶标通路(表4)包括多种信号通路，主要有呼吸电子传输，PIP3激活AKT信号，PIP5、PP2A和IER3调节PI3K/AKT信号，MAP2K和MAPK激活，由RAS突变体发送信号，VEGFR2介导的细胞增殖等。其中PI3K/Akt信号通路可以调节内皮细胞生成及代谢(能量代谢、脂肪代谢、糖代谢等)〔14〕、炎症和凋亡〔15〕、自噬〔16〕等多种生物活动，参与冠心病的病理形成过程，是治疗的重要靶点。此外，还发现通过PI3K/AKT信号通路调节血小板聚集，降低SD大鼠心肌细胞损伤程度〔17〕。由此可知，PI3K/AKT作为已被证实可以参与多种细胞生物过程的信号通路，推测三七活性成分可能通过调节此通路发挥缓解心绞痛的作用。

VEGF作为一种血管生长因子，主要通过血管内皮生长因子受体(VEGFR)2信号通路发挥促进内皮细胞增殖、血管新生的作用，是目前治疗冠状动脉粥样硬化相关疾病的新方向。田伟等学者〔18〕发现人参三七组方的提取物可能通过影响VEGFR-2、Ras、MAPK这三个关键信号蛋白的表达，促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管新生的作用；进一步通过动物实验观察〔19〕，发现可通过Ras信号通路来促进急性心肌梗死大鼠的血管新生。Li等〔20〕指出通过调节VEGFR2-SRC-ve-钙黏蛋白复合物的形成，增加细胞表面ve-钙黏蛋白，抑制血管通透性，降低梗死面积、出血和炎症等。Wawrzyńska等〔21〕还发现心血管支架的快速内皮化与VEGFR2有关，这对于预防再狭窄等主要临床并发症至关重要。此外，肾素血管紧张素系统(RAS)及其主要介质血管紧张素(Ang)Ⅱ可通过对内皮功能、炎症、纤维蛋白溶解平衡和斑块稳定性的影响直接影响动脉粥样硬化过程的进展〔22〕；亦可通过阻断RAS 改善心脏肌膜Na+-K+-ATPase和Na+/Ca2+的交换活动，缓解心肌梗死导致的心力衰竭〔23〕。MAPK-ERK1/2信号通路与大鼠心肌缺血再灌注损伤及心肌细胞凋亡相关〔24〕。由此可知，三七活性成分可能通过调节血管新生、血管内皮功能、细胞凋亡及增殖等，发挥保护心肌的作用，进而起到治疗心绞痛的作用。

表3 三七治疗冠心病心绞痛靶标基因功能分析

2.5三七治疗冠心病心绞痛“中药材-成分-核心靶标-通路-疾病”多维网络分析 基于TCMIP平台构建三七治疗冠心病心绞痛的疗效机制“中药材-成分-核心靶标-通路”多维网络。相关通路主要有雌激素依赖性基因表达、HATs乙酰化组蛋白、PPARα激活基因表达、ABC家族蛋白介导转运、核受体转录途径、细胞内受体的蛋白修饰、内源性甾醇等(图2)。从候选靶标网络与“中药材-成分-核心靶标-通路”网络图，推测三七对冠心病心绞痛的干预作用可能与PPARα激活基因表达、ABC家族蛋白介导转运、核受体转录途径及雌激素依赖性基因表达等有关。PPARα激动剂通过上调ABCA1蛋白的表达，促使胆固醇流出〔25〕，减缓冠心病的进程，起到保护心肌的作用。Meyer等〔26〕指出在绝经前妇女中，内源性雌激素与冠状动脉疾病、心肌梗死和发病率降低有关，并认为活化G蛋白耦联雌激素受体(GPER)可为冠状动脉疾病患者的一级和二级预防提供治疗益处。

表4 三七治疗冠心病心绞痛关键靶标通路富集分析

方形为丹参；菱形为成分；圆形为核心靶标；三角形为通路图2 三七治疗冠心病“中药材-成分-核心靶标-通路”多维网络关系

3 讨 论

近年来研究发现三七总皂苷(PNS)对于冠状动脉疾病的作用机制包括调节炎症、脂质代谢、血管生成〔27〕；通过提高血小板环磷酸腺苷的含量及减少血栓素A2的生成发挥抗血栓作用的〔28〕；通过线粒体途径减弱心肌细胞凋亡〔29〕；抗氧化应激反应、抑制核因子(NF)-κB/诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达,从而改善内皮功能,减轻内皮细胞损伤有关〔30〕；通过自噬途径减轻心肌缺血再灌注损伤〔31〕；抑制脊髓胶质细胞的激活，可缓解急性炎性内脏痛〔32〕。此外，三七还能诱使血小板释放花生四烯酸、Ca2+、血小板凝血因子Ⅲ等止血活性物质，达到止血作用〔33〕。三七总多糖具有抗炎、抗氧化、降血脂及调节免疫的功能等〔34〕。由此可知三七通过多途径、多靶点，起到扩张血管、增加心肌血流量及心肌营养状况，改善心肌功能及心肌微循环，以干预冠心病、冠心病心绞痛等疾病问题。

本研究借助中医药整合药理学研究平台v2.0，发现三七对冠心病心绞痛的干预作用可能与PPARα激活基因表达、ABC家族蛋白介导转运、核受体转录途径等有关。但本研究所得的结果仍有局限性，基于依托TCMIP平台及数据库，通过数据挖掘药物功能和作用的预测可能存在不足，未来还需要在基础和临床实验中进一步证实；三七本身的活性成分可能有更广泛的潜在治疗作用。故本文为进一步科研及临床提供思考方向及理论依据，仍需要不断完善。