大鼠多次给予染料木素甲氧基封端的聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物胶束的药动学研究

何礼 韩瑞伟 阎雪莹

[摘要] 目的 討论染料木素（GEN）甲氧基封端的聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物（MePEG-PLGA）胶束多次给药在健康大鼠体内的药动学行为。 方法 将24只健康Wistar大鼠按体重分成四组，每组6只，分别为GEN乳剂组，GEN胶束低、中、高剂量组。每组分别多次尾静脉注射GEN乳剂和GEN胶束，乳剂剂量为40 mg/kg，胶束剂量分别为20、40、60 mg/kg。采用高效液相色谱法（HPLC）测定给药后不同时间点血浆中GEN浓度。 结果 GEN乳剂组和GEN胶束组最小血药浓度（Cmin）、半衰期（t1/2）、药时曲线下面积（AUC0～t）、清除率（CL）、波动系数（DF）比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）;GEN胶束低、中和高3个剂量组主要药动学参数Tmax、t1/2、CL、表观分布容积（Vd）和DF比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与GEN胶束低剂量组比较，GEN胶束中剂量组最大血药浓度（Cmax）、AUC0～t升高，与GEN胶束低、中剂量组比较，GEN胶束高剂量组Cmax、AUC0～t升高，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。GEN胶束各剂量组AUC0～t、AUC0-∞、Cmax、平均稳态浓度（Cav）随给药剂量增大而增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01），AUC0-t、AUC0-∞、Cmax、Cav与剂量呈线性关系（r > 0.97）。在相同剂量下，单次和多次给药后的主要药动学参数Cmax、t1/2、AUC0～t、CL、Vd、MRT0～t差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 GEN胶束能明显延迟GEN在大鼠体内滞留时间，提高生物利用度，且血药浓度与剂量呈线性关系，多次给药后在大鼠体内不存在蓄积现象。

[关键词] 染料木素;MePEG-PLGA胶束;多次给药;药动学

[中图分类号] R969.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）05（c）-0017-05

Pharmacokinetic study of genistein -loaded methoxy-terminated polyethylene glycol-lactic acid glycolic acid copolymer micelles after multiple dosing in rats

HE Li1   HAN Ruiwei1   YAN Xueying2

1.Laboratory for Medicinal Resources and Utilization in Northwest Sichuan， Sichuan University of Traditional Chinese Medicine， Sichuan Province， Mianyang   621000， China; 2.College of Pharmacy，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin   150040， China

[Abstract] Objective To discuss the pharmacokinetic behavior of genistein （GEN） methoxy-terminated polyethylene glycol-lactic acid glycolic acid copolymer （MePEG-PLGA） micelles administered multiple times in healthy rats. Methods Twenty-four healthy Wistar rats were randomly divided into four groups according to their body weight， with 6 rats in each group， namely the GEN emulsion group and the GEN micelle low， medium and high dose groups. In each group， GEN emulsion and GEN micelles were injected into the tail vein several times， respectively， with the emulsion dose of 40 mg/kg and the micelle dose of 20， 40 and 60 mg/kg. The high performance liquid chromatography （HPLC） was used to analysis drug delivery in different time points after plasma GEN concentration. Results The differences in minimum blood drug concentration （Cmin）， half-life （t1/2）， area under the curve （AUC0-t）， clearance rate （CL） and fluctuation coefficient （DF） between GEN emulsion group and GEN micelles group were statistically significant （P < 0.01）. There were no statistically significant differences in the major pharmacokinetic parameters Tmax， t1/2， CL， apparent distribution volume （Vd） and DF in the GEN micelles groups with low， medium and high doses （P > 0.05）. Compared with the low-dose group of GEN micelles， the maximum blood concentration （Cmax） and AUC0-t in the medium-dose group of GEN micelles were increased， while the Cmax and AUC0-t in the high-dose group of GEN micelles were increased compared with the low-dose and medium-dose group of GEN micelles， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. The differences of AUC0-t， AUC0-∞， Cmax and average steady stateconcentration （Cav） in each dose group of GEN micelles increased with the increase of the dose （P < 0.01）， and there was a linear relationship between AUC0-t， AUC0-∞， Cmax and Cav and the dose （r > 0.97）. There were no significant differences in the major pharmacokinetic parameters Cmax， t1/2， AUC0-t， CL， Vd， MRT0-t between single and multiple doses at the same dose （P > 0.05）. Conclusion GEN micelles can significantly delay the retention time of GEN in rats and improve the bioavailability. Moreover， there is a linear relationship between blood drug concentration and dose， and there is no accumulation in rats after repeated drug administration.

[Key words] Genstein; MePEG-PLGA micelle; Multiple dosing; Pharmacokinetics

染料木素（genstein，GEN）是一种大豆异黄酮类活性成分，其结构与雌激素相似，又被称为“植物雌激素”。GEN可通过直接与体内雌激素受体（estrogen receptor，ER）结合或通过调节内源性雌激素分泌等途径发挥作用，对肿瘤、女性更年期综合征、骨质疏松等疾病有良好疗效[1-9]，目前国内外已有多个制剂获准进入临床研究[10-13]。然而GEN在水中几乎不溶，且存在较强的首过效应，直接口服生物利用度低，极大限制了其临床应用[14-16]。为解决GEN低溶解度及提高GEN的生物利用度，本课题组采用MePEG-PLGA为载体成功制备GEN胶束冻干针剂[17]。体外释放动力学研究显示，GEN胶束具有良好的缓释特性[18]。单次给药药动学研究显示，染料木素制备成胶束后明显延长消除半衰期，曲线下面积（AUC）显著增加，消除率显著降低，延长了染料木素在循环系统中的滞留时间，相对生物利用度显著提高[19-20]。目前关于GEN胶束在大鼠体内多次多剂量药动学研究及其药物蓄积研究尚无报道，本研究旨在考察GEN胶束多次多剂量给药后的药动学行为，进一步探讨其药动学特征，为其临床合理应用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010 AHT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）;R-205B型旋转蒸发器（上海申胜生物技术有限公司）;W202B型数控恒温浴锅（上海申胜生物技术有限公司）;Scientz-ⅡD型超声波细胞破碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药

GEN对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111704-200502）;GEN原料药（西安小草植物科技有限责任公司，批号：XC100310）;GEN胶束灭菌注射用粉末（实验室自制，5 mL安瓿瓶盛装，GEN 2.0 mg/瓶，生产批号：20180717）;MePEG-PLGA（济南岱罡生物科技有限公司，批号：102106）;聚乙烯醇（PVA，北京益利精细化学品有限公司;醇解度：88%）;二氯甲烷（北京北化精细化工品有限公司）;透析袋（美國Sigma公司，MW=8000～14400）;甲醇（色谱纯，DIKMA公司）;其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

清洁级健康Wistar大鼠24只，8～12周，雌雄各半，体重（200±20）g，黑龙江中医药大学药物非临床研究（GLP）实验室提供[合格证号：SCXK（黑）2017-0013]，通过动物伦理学审核，饲养条件：室温（25±2）℃，相对湿度为（50±10）%，每天交替12 h光照，自由饮水和进食。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

LC-2010 AHT型高效液相色谱仪，配有四元梯度泵，恒温标准自动进样器，可变波长扫描紫外检测器和工作站（日本岛津公司）;色谱柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;检测波长：260 nm;流动相：甲醇-水（60∶40）;流速：1.0 mL/min;柱温：30℃;进样量：10 μL。

2.2 血浆样品预处理

精密吸取100 μL血浆样品，置于1.5 mL离心管中，加入200 μL甲醇沉淀血浆蛋白，涡旋混合1 min，10 000 r/min离心10 min，吸取全部上清液过微孔滤膜（0.22 μm）用于高效液相色谱（HPLC）分析。

2.3 溶液制备

精密称取GEN对照品8.80 mg，置于50 mL容量瓶中，用稀释至刻度，得0.176 mg/mL的对照品贮备液。

精密称取约10 mg GEN胶束，置于离心管中，加入10 mL二氯甲烷，涡旋溶解，混悬液离心10 min（转速5000 r/min），重复2次，合并上清液并用二氯甲烷定容至20 mL，即得供试品溶液。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性考察  取小鼠空白血浆、加0.2 μg/mL GEN标准溶液的大鼠血浆、静脉注射GEN胶束后90 min的大鼠血浆样品，按“2.2”项下处理，分别得到空白血浆、加药血浆和含药血浆样品的色谱图，血浆中其他物质均不干扰GEN测定。见图1。

2.4.2 标准曲线绘制  分别精密量取“2.3”项下GEN对照品贮备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得浓度1.76、3.52、7.04、14.08、28.16、56.32、112.64 μg/mL的系列溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，得GEN标准曲线方程为Y = 124 815X +37 925，r = 0.9999。

2.4.3 精密度试验  制备GEN浓度为1.76、14.08、112.64 μg/mL的血浆样品各6份，处理后连续进样6次，得日内精密度，连续进样6 d，得日间精密度。GEN对照溶液日内精密度RSD值分别为0.46%、0.63%、1.24%（n = 6），日间精密度RSD值分别为0.94%、1.21%、2.05%（n = 6），精密度满足分析要求。

2.4.4 回收率试验  制备GEN浓度为1.76、14.08、112.64 μg/mL的血浆样品各6份，进样分析，以加入量和测得量计算提取回收率。低、中、高浓度样品的平均回收率分别为（97.10±0.89）%、（96.80±0.94）%、（98.10±0.78）%（n = 6），回收率满足分析要求。

2.4.5 稳定性试验  取同一批次制备的GEN胶束于室温下放置0、2、4、8、12、24 h，计算GEN浓度的RSD值为1.73%，稳定性满足分析要求。

2.4.6 重复性性试验  取同一批次制备的GEN胶束6份，平行配制供试品溶液进样分析，计算GEN浓度的RSD值为1.06 %，重复性满足分析要求。

2.5 药动学研究

2.5.1 实验动物与给药方案  健康Wistar大鼠12只，雌雄各半，按照体重分为两组，每组6只，分别为GEN乳剂组和GEN胶束组。实验前禁食12 h，自由饮水。各组称重后，尾静脉注射给药（剂量为40 mg/kg），于给药后0.00、0.083、0.170、0.500、1.000、2.000、4.000、6.000、 8.000、10.000、12.000、24.000 h从眼眶后静脉丛取血约0.4 mL，冷冻保存。

健康Wistar大鼠24只，雌雄各半，按照体重随机分为四组，每组6只，分别为GEN乳剂组，GEN胶束低、中、高剂量组。实验前禁食12 h，自由饮水。根据给药剂量设为GEN乳剂组（40 mg/kg）[按2015版《中华人民共和国药典》[21]（一部）中规定，本研究设定剂量接近人临床等效剂量]、GEN胶束低（20 mg/kg）、中（40 mg/kg）、高（60 mg/kg）剂量组。各组称重后，尾静脉注射给药，给药间隔24 h，连续7次，于第4、5、6次给药前采血作为谷浓度，并于末次给药后0.000、0.083、0.170、0.500、1.000、2.000、4.000、6.000、8.000、10.000、12.000、24.000 h从眼眶后静脉丛取血约0.4 mL，冷冻保存。

2.5.2血药浓度-时间曲线  按“2.5.1”项下给药方案，分别计算单次给药和多次给药各组各时间点血药浓度，其平均血药浓度-时间曲线见图2和图3。

2.5.3 多次给药GEN乳剂组和GEN胶束组药动学参数比较  在相同给药剂量下，GEN乳剂组与GEN胶束组最小血药浓度（Cmin）、半衰期（t1/2）、药时曲线下面积（AUC0～t）、清除率（CL）、波动系数（DF）比较，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。见表1。

2.5.4 不同剂量GEN胶束组药动学参数比较  采用DAS 3.0软件进行非房室模型拟合并计算药动学参数，最大血药浓度（Cmax）和达峰时间（Tmax）采用实测值，AUC0～t采用梯形法计算。大鼠静脉注射GEN胶束后，GEN胶束低、中和高3个剂量组主要药动学参数Tmax、t1/2、CL、表观分布容积（Vd）和DF比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;与GEN胶束低剂量组比较，GEN胶束中剂量组Cmax、AUC0～t升高，与GEN胶束低、中剂量组比较，GEN胶束高剂量组Cmax、AUC0～t升高，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。见表2。

2.5.5多次给药不同剂量GEN胶束组药动学参数比较及其与剂量的相关性分析  与GEN胶束低剂量组比较，GEN胶束中剂量组AUC0～t、AUC0～∞、Cmax、平均稳态浓度（Cav）升高，与GEN胶束低、中剂量组比较，GEN胶束高剂量组AUC0～t、AUC0～∞、Cmax、Cav升高，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。AUC0-t、AUC0-∞、Cmax、平均稳态浓度（Cav）与剂量呈线性关系（r > 0.97）。见表3。

2.5.6 GEN胶束单次给药和多次给药药动学参数比较在剂量相同情况下，大鼠单次给药和多次给药后的主要药动学参数Cmax、t1/2、AUC0～t、CL、Vd、MRT0～t差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

3 讨论

目前国内外现尚无GEN相关注射制剂，且GEN在水中溶解度很差，无法直接将GEN溶解在生理盐水中进行大鼠的尾静脉注射，根据参比制剂选择原则，实验中将GEN制成乳剂作为参比制剂与GEN胶束冻干针剂进行比较。

与GEN乳剂组比较，GEN胶束组MRT0-t显著延长，主要原因为将亲水性的PEG通过酯键共价连接到PLGA上，形成PEG包衣的纳米粒子，有效避免了網状内皮吞噬系统的识别和吞噬，延长了体内循环时间。

使用多次给药测定生物利用度可以揭示单次给药研究所观察不到的变化。多次给药后，从第4天血药浓度已基本稳定，提示已达到稳态。与前期大鼠单次注射GEN胶束药动学结果比较，可以看出多次给药达稳态后的主要药动学参数Cmax、t1/2、AUC0～t、CL、Vd、MRT0～t差异均无统计学意义（P > 0.05）。多次给药Cav分别为1.900、4.098、1、7.904 mg/L，波动系数DF分别为4.036、3.862、3.644，提示GEN胶束多次给药后在正常大鼠体内不存在蓄积现象，连续给药不改变GEN胶束冻干针剂的药动学特征。

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（收稿日期：2019-11-13  本文编辑：刘永巧）