固本健脑液对阿尔兹海默症大鼠生物钟基因Clock、Bmal1及海马Aβ的影响

张誉丹 毛剑琴 袁林 袁德培

摘要 目的：通過观察固本健脑液对AD大鼠学习记忆、生物钟基因及海马Aβ含量的影响，探索该方改善学习记忆和睡眠障碍的可能机制。方法：实验大鼠随机分为正常组、模型组、药物高、中、低剂量组。自主活动分析仪检测各组大鼠的自主活动情况;Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力;ELISA检测大鼠海马Aβ1-40和Aβ1-42含量;免疫组化检测SCN中Bmal1和Clock的蛋白表达水平。结果：自主活动结果显示模型组大鼠活动时间较空白组呈现出显著的增加（P<0.01）;各给药组出现活动时间减少（P<0.05）。Morris水迷宫结果显示，模型组大鼠较空白组逃避潜伏期显著延长，目标象限游泳时间百分比显著下降（P<0.01）;各观察组逃避潜伏期显著缩短，目标象限游泳时间百分比显著上升（P<0.01，P<0.05）;ELISA结果显示，模型组大鼠海马Aβ1-40和Aβ1-42含量较空白组显著增多（P<0.01），固本健脑液中、高剂量组海马Aβ1-40和Aβ1-42含量显著下降（P<0.01）。免疫组化结果：模型组大鼠SCN中Bmal1和Clock表达水平较空白组下降（P<0.01），给药后，各组大鼠SCN中Bmal1和Clock表达上升（P<0.05）。结论：结果显示AD大鼠存在一定程度的昼夜节律紊乱且生物钟节律基因表达降低，固本健脑液干预后可改善痴呆大鼠的昼夜节律紊乱及海马Aβ的异常表达，其机制则可能与固本健脑液上调Bmal1、Clock表达有关。

关键词 固本健脑液;阿尔兹海默症（AD）;Bmal1基因;Clock基因;β-淀粉样蛋白（Aβ）

Effect of Root-Securing and Brain-Fortifying Liquid（RSBFL）on Bmal1，Clock in Hypothalamus and Aβ in Hippocampus of Alzheimer′s Disease Rats

ZHANG Yudan1，MAO Jianqin2，YUAN Lin2，YUAN Depei1

（1 School of Basic Medical Sciences，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China; 2 Hubei Minzu University for Medical Department/ Hubei University for Nationalities Rheumatic Disease Occurrence and Intervention Hubei Provincial Key Laboratory，Enshi 445000，China）

Abstract Objective：To explore the possible mechanisms of improving learning and memory and sleep disorders were explored by observing the effects of Root-Securing and Brain-Fortifying Liquid（RSBFL）on learning and memory，biological clock gene and the content of hippocampal Aβ in AD model rats.Methods：The rats were randomly divided into a normal group，a model group，a high，a medium and a low dose groups.The autonomic activity of rats in each group was detected by autonomic activity analysis system.Morris water maze was used to test the learning and memory ability of rats in each group.ELISA was used to detect the contents of Aβ1-40and Aβ1-42 in the hippocampus of rats.Immunohistochemistry was used to detect the protein expression levels of Bmal1 and Clock in SCN.Results：The results of autonomic activity showed that compared with the normal group，the activity time of rats in the model group increased significantly（P<0.01）; compared with the model group，the activity time of rats in each drug group decreased to different degrees（P<0.05）.Morris water maze results showed that compared with the blank control group，the escape latency period of rats in the model group was significantly prolonged，and the percentage of target quadrant swimming time was significantly decreased，with statistically significant differences（P<0.01）; compared with the model group，the evasive incubation period of each treatment group was significantly shortened，and the percentage of target quadrant swimming time was significantly increased，with statistically significant differences（P<0.01，P<0.05）.ELISA results showed that compared with the blank control group，the contents of Aβ1-40and Aβ1-42 in hippocampus were significantly increased in the model group（P<0.01）.Compared with the model group，the contents of Aβ1-40and Aβ1-42 in hippocampus of rats in the medium and high dose RSBFL groups decreased significantly（P<0.01）.Immunohistochemical detection results：the expression levels of Bmal1 and Clock in SCN of rats in the model group decreased（P<0.01）compared with that in the blank control group.After administration，HE expression levels of Bmal1 and Clock in SCN of rats in each group increased（P<0.05）.Conclusion：The results of this study show the AD model rats had a certain degree of circadian rhythm disorder and the expression of circadian rhythm gene was decreased.The intervention of RSBFL can improve circadian rhythm disorders and abnormal expression of Aβ in hippocampus of dementia rats，and the mechanism may be related to the upregulation of Bmal1 and Clock expression of RSBFL.

Keywords Root-Securing and Brain-Fortifying Liquid（RSBFL）; Alzheimer′s disease（AD）; Bmal1gene; Clock gene; β-amyloid（Aβ）

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.23.016

阿尔茨海默病（Alzheimer′s Disease，AD）又叫老年性痴呆，是一种退行性脑部疾病，普遍认为是海马型遗忘综合征，是痴呆症最常见的病因，在全球范围内占痴呆病例的50%～75%[1-2]。随着全球人口老龄化进程的加快，老年性痴呆的发病率呈现出持续上升的趋势，不仅成为一个广泛关注的社会问题，同时也为家庭带来异常沉重的负担，研究表明[3]，不同程度的昼夜节律紊乱在AD患者和相关AD动物模型中均有体现，其中就表现为睡眠-觉醒节律紊乱以及静息-活动节律紊乱，同时也表现出机体的一些激素方面的昼夜节律紊乱;同时也有研究指出存在于AD患者中的长期昼夜节律紊乱也可导致AD的病理进程加快，已证实约有44%的阿尔茨海默病患者伴有睡眠障碍[4]。而导致这一结果的发生正是由于随着机体的衰老进程加快，往往最先表现出的病理状态就是昼夜节律的受累，因此这种与AD伴发的睡眠障碍在AD的发病过程中表现尤为突出[5]。因此，实验基于生物钟基因Bmal1、Clock的生物学效应，建立AD大鼠模型，并通过中药固本健脑液予以干预，以期探讨固本健脑液改善AD模型大鼠的昼夜节律紊乱与调节生物钟节律基因有密切关联。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 50只SPF级雄性SD大鼠（海南医学院实验动物中心，许可证号：SCXK（琼）2019-0006），体质量220～250 g。在常规条件下适应性喂养1周后开始实验。该实验经本院动物伦理委员会批准（伦理审批号：2019-009）。

1.1.2 药物 固本健脑液是由板桥党参15 g、枸杞子15 g、茯苓15 g、酸枣仁12 g、山楂12 g组成，加入6倍量水后煎煮2次，滤出药液后将2次药液混合，加热浓缩成药液浓度分别含生药2.5、1.25、0.625 g/mL的水煎液，保存于4 ℃冰箱，备用。

1.1.3 试剂与仪器 Aβ1-40（Sigma公司，美国，货号：A9810-0）、ELISA检测试剂盒[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号：SE0105-96]、Bmal1、Clock均为兔抗鼠抗体（购自Santa公司，美国，批号分别为：sc365645、sc271603）;辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠二抗（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA1054），ZH-ZH型自主活动测试仪（安徽淮北正华，型号：ZH0065）、电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司，型号：BS110S）、冷冻离心机（Beckman公司，美国，型号：CS-15R）、BCD冰箱（深圳市宝安区沙井广氏电器厂，型号：BCD-629WDEYU1）、

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型建立 50只实验用SPF级雄性SD大鼠采用随机数字表法将其分为空白对照组、模型组、固本健脑液低、中、高剂量组。大鼠适应性喂养1周后，除空白对照组外，其余各组建立AD模型，具体方法如下：大鼠称重后，用100%异氟醚吸入麻醉大鼠，然后将其置于脑立体定向仪上，用外科剪刀刮掉头顶的毛皮，并用碘伏消毒，再把一次性手术毛巾盖在头上。用手术刀和剪刀沿颅骨正中切开一道口子，分离皮下组织和筋膜，用无菌干棉擦拭头盖骨止血，并用记号笔在前庭作记号。以脑立体定位仪为参照，零点标记在前囟“十”字缝中心，矢状线左右各3 mm处，正中线后4 mm处，做好位置标记，钻孔后使用微量進样器吸取2 μL Aβ1-42，注射进孔后留针2 min，后缓慢拔出针头，对侧操作相同。操作结束后，缝合创口并用碘伏消毒，后涂抹红霉素软膏，此后连续3 d肌注10万单位青霉素预防感染，记录造模日期。空白对照组同上位置注射0.9%氯化钠溶液，其余操作相同。

1.2.2 给药 固本健脑液低、中、高剂量组以上述配制的水煎液浓度，给予各组大、鼠10 mL/kg/d灌胃;空白对照组和模型组用给予等体积的生理盐水。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 Morris水迷宫行为学测定 用几滴食用色素使池水变黑，然后将水深保持在31.5 cm，温度保持在（23±1）℃，在水面以下设置1.5 cm圆形透明有机玻璃平台，确保水迷宫周围的所有空间信号在水迷宫测试期间保持不变，用虚线将池划分为4个相等的象限，以进行描述性数据收集，将隐藏平台放置在水迷宫的第三象限（Q3），提捏大鼠尾部将其面向池壁分别从4个象限的固定位置进入水中，通过摄像机在连接到基于计算机的图形分析软件的水迷宫上捕捉大鼠的游泳行为，记录小鼠寻找平台的逃避潜伏期，并计算其平均隐藏潜伏期。

自主活动时间检测：最后一次灌胃之后，用自主活动监测仪观察各组大鼠自主活动时间6 min，前3 min为适应性训练，不计入最后统计，后3 min纳入统计分析。

1.2.3.2 ELISA检测大鼠海马组织中Aβ1-40和Aβ1-42含量 行为学检测结束后，用100%异氟醚吸入麻醉大鼠，拉颈法处死大鼠，迅速取脑组织，分离皮层和海马组织，用pH值7.4的PBS制成含30%海马组织的悬液，3 000 r/min离心15 min，离心半径13.8 cm。取上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书进行检测，酶标仪450 nm处检测吸光度。

1.2.3.3 免疫组化检测下丘脑SCN中Bmal1、Clock表达 将多聚甲醛溶液浸泡的脑组织行石蜡包埋，后切片，厚度为5 μm，然后将切片进行脱蜡处理，脱蜡处理完成的切片使用3%H2O2浸泡15 min，后用PBS冲洗切片3，操作重复3次，3 min/次;冲洗完成后在切片表面滴加一抗Bmal1（1∶100）和Clock（1∶200），室温孵育1 h;PBS冲洗切片3次，3 min/次;后滴加二抗（1∶1 000），室温孵育15 min;再一次用PBS冲洗切片3次;以上步骤完成后滴加DAB显色液孵育5 min;最后对切片进行水洗、复染、脱水和透明。镜下观察切片，从每组切片中分别选取5个高倍（×400）视野，用Image Pro Plus 6.0对图像进行处理并获取IOD值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 固本健脑液对AD大鼠学习记忆的影响 与空白组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，目标象限游泳时间百分比显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，各观察组逃避潜伏期显著缩短，目标象限游泳时间百分比显著上升，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。说明固本健脑液可以改善AD大鼠的学习记忆能力。见表1。

2.2 自主活动时间检测结果 与正常组比较，模型组大鼠表现为活动时长的显著延长（P<0.01）;与模型组比较，各给药组大鼠的活动时长表现为显著减少（P<0.05）。见表2。

2.3 固本健脑液对大鼠海马组织中Aβ1-40和Aβ1-42含量的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠海马Aβ1-40和Aβ1-42含量显著增多，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，固本健脑液中、高剂量组大鼠海马Aβ1-40和Aβ1-42含量显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。

2.4 免疫组化实验结果 空白组大鼠SCN中Bmal1和Clock表達水平较高，造模后，模型组大鼠SCN中Bmal1和Clock表达水平下降（P<0.01），给药后，各组大鼠SCN中Bmal1和Clock表达上升（P<0.05）。各组大鼠SCN中Bmal1和Clock的IOD（累积光密度）值见图1、图2、图3。

3 讨论

研究表明，睡眠节律紊乱与AD的发生发展存在十分密切的联系，二者有着紧密的交互作用。有实验表明，对AD模型鼠的慢性睡眠剥夺可加速AD鼠脑内的β-淀粉样蛋白（Aβ）异常沉积，从而使得学习记忆障碍加重[6-8]。这种睡眠障碍与AD之间的关联性也为研究AD的发病机制提供了新的思路。

而本研究方固本健脑液能补脾肾之虚，固人体精气血之本，从而健脑安神，结合古今医家对失眠发生病因病机的认识，认为老年失眠主要是脾肾等脏腑虚衰，气血不足所致[9-10]。所以其治疗也当以补肾健脾，以养精气血之本，使健脑神安为主，故用本方以达固本健脑之功。该方的前期研究证实了固本健脑液能有效改善老年大鼠的失眠状态，改善下丘脑细胞异变状态，并通过上调GABAARα1、GABAARγ2、降低NKCC1加强GABA与其受体的结合改善睡眠剥夺大鼠的睡眠障碍从而达到改善睡眠的作用[11-12]。

本研究的实验结果显示AD模型大鼠存在一定程度的昼夜节律紊乱，生物钟节律基因Bmal1、Clock表达降低，而使用固本健脑液干预后可改善痴呆大鼠的昼夜节律紊乱，改善了海马Aβ的异常表达，其机制则可能与固本健脑液上调Bmal1、Clock表达有关。自从Clock基因被发现以后，陆续有更多的与昼夜节律相关的生物钟基因被发现，包括Clock、时钟管理基因Bmal1、系列周期基因Per1、Per2、Per3等[13-15]其中，生物钟基因Clock可以与Bmal1的产物相结合，形成Clock/Bmal1异二聚体，又可激活Per以及Cry的转录，这一系列的节律基因和他们的蛋白产物相互作用，这种分子机制，对于保证昼夜节律正常运转有着重要意义[16-17]。也有研究证明随着机体的逐渐衰老，SCN中Clock、Bmal1、Per及Cry等一系列节律基因的表达也有所降低，且研究还发现AD患者脑中Bmal1的表达也会失去节律性[18-19]。除此之外，Aβ的异常沉积也会使SCN出现损害，发生明显萎缩，体积减小[20]。本实验结果也证明了通过固本健脑液的干预可降低痴呆大鼠海马Aβ的表达的同时改善睡眠障碍。

因此可以得知在对AD的预防和治疗的研究中同时进行对于昼夜节律与AD的交互作用的研究具有非常重要的意义，这种昼夜节律系统紊乱和阿尔茨海默病的病因机制中的共同的特征，也揭示了将它们作为一条相互依赖的途径进行研究的前景，将来也有可能为AD提供新的治疗思路。恢复AD患者的昼夜节律改善睡眠可能不再仅仅只是对症治疗，在今后极有可能成为针对AD的病因从而进行预防的有效措施。

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（2020-03-16收稿 责任编辑：王明）