液-液萃取法从金银花中分离纯化绿原酸

崔春雨，杨宇婷，肖 丽，李 青

(河南师范大学 化学化工学院实验教学示范中心，河南 新乡 453007)

绿原酸具有多种生物活性[1-2]，是众多中药药材、饮片以及中成药的主要有效成分，有很大的市场需求和药用前景。绿原酸在多种植物中存在，但其在忍冬科忍冬属(Lonicera)中含量较多。绿原酸是判断金银花质量的重要指标之一[3]。绿原酸的提取方法有很多，目前主要有石硫醇法[4]、大孔树脂吸附[5]、双水相萃取法[6]、超临界流体萃取法[7]等多种方法。绿原酸化学性质较不稳定，目前其分离纯化工艺主要是柱层析法，存在着工艺复杂、能耗大、提取率低等问题。因此，寻找成本较低、操作简单、可工业化生产的绿原酸分离纯化工艺具有很大的价值。

1 实验部分

1.1 材料和仪器

主要仪器: Waters 600 高效液相色谱仪，Waters 2487 检测器，C18色谱柱(安捷伦，4. 6 mm×250 mm，5μm)。

试剂:甲醇、乙腈(色谱纯，天津四友公司)；乙酸乙酯、乙醇、硫酸铵(分析纯，西陇化工股份有限公司)；绿原酸标准品(上海晶纯试剂有限公司，产品批号1313098)。

1.2 实验过程

1.2.1 金银花浸膏水溶液的制备

称取1000g的金银花，粉碎后加入4000mL乙醇水溶液(乙醇体积百分比为60%)，加10%盐酸调节pH值=5左右，超声波辅助浸提3次，每次时间为1h，合并浸提液，减压蒸馏浓缩成浸膏，加去离子水制成500mL金银花浸膏水溶液，备用。

1.2.2 绿原酸的富集

采用液液萃取方法，用有机溶剂选择性萃取以实现绿原酸的初步富集。乙酸乙酯可以从金银花浸膏水溶液中萃取出少量绿原酸，通过多次萃取，大部分绿原酸还是分配于水相中，因此，金银花浸膏水溶液通过乙酸乙酯萃取除去极性小于绿原酸的杂质。然后，乙醇中加入恰当比例的乙酸乙酯降低其极性，作为混合有机溶剂选择性萃取绿原酸。利用无机盐/亲水有机溶剂双水相体系萃取原理[8]。浸膏水溶液中加入适量硫酸铵，促使乙醇与浸膏水溶液相分层。本实验在金银花浸膏水溶液中加入硫酸铵固体，通过V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=9∶91选择性萃取富集绿原酸。

取50mL金银花浸膏水溶液，加入4g硫酸铵固体，搅拌溶解，用等体积的体积百分数为9%的乙醇-乙酸乙酯萃取8次即可将大部分绿原酸萃出，合并8次萃取液成400 mL，分成4等份，每份100mL。分别将为2，3，4，5g的活性炭装入层析柱，在常温常压条件下，将4份萃取液过活性炭柱进行吸附脱色。

1.2.3 绿原酸的分离纯化

经活性炭吸附后的乙醇-乙酸乙酯萃取液经减压蒸馏浓缩得到绿原酸粗品。绿原酸粗品经混合溶剂V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=3∶2进行重结晶，得到绿原酸白色粉末状晶体。

1.3 高效液相色谱法测定绿原酸含量

1.3.1 色谱条件

柱温:30℃;流动相∶乙腈∶0.4%磷酸溶液(11∶89);流速:1.0mL/min;检测波长326nm。

1.3.2 线性关系的考察

精密称取绿原酸对照品，加30%甲醇稀释溶解配制为浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.12，0.14 mg·mL-1溶液。分别吸取以上对照品浓度各10μL注入液相色谱仪。以峰面积值为纵坐标,对照品浓度为横坐标，得回归方程为Y=5×107X+32076,相关系数R2=0.9996。结果表明，绿原酸进样量在0.02～0.14mg·mL-1范围内，峰面积跟浓度线性关系良好。

1.3.3 测定供试品绿原酸含量

取萃取后上下相溶液各1mL用流动相稀释定容至100mL，然后再取上述溶液1mL用流动相稀释至100mL，用高效液相色谱仪测定时进样量为10μL，测定峰面积值。

2 结果和讨论

2.1 萃取体系的选择

考察硫酸铵水溶液与乙醇-乙酸乙酯混合溶剂形成液-液双相平衡体系的质量浓度。混合溶剂乙酸乙酯和乙醇的比例决定了硫酸铵的质量浓度，如表1所示：

表1 不同体积比乙醇-乙酸乙酯跟等体积水分层所需硫酸铵用量Table 1 The quality of ammonium sulfate cause to layered between different ratio of ethanol and ethyl acetate and the isovolumetricwater

2.2 混合萃取溶剂乙醇-乙酸乙酯比例的确定

取350mL金银花浸膏水溶液，先用乙酸乙酯等体积萃取6次去除极性小于绿原酸的杂质，再将浸膏水溶液分成7份，每份50mL，加入硫酸铵固体，使浸膏水溶液中硫酸铵质量分数为5%,6%,8%,10%,13%,15%，再依照顺序用体积比为3∶97,6∶94,9∶91,12∶88,15∶85,18∶82的乙醇-乙酸乙酯混合溶剂对金银花浸膏水溶液进行萃取，其中乙醇-乙酸乙酯(18∶82)作为萃取剂时，上相萃取液经薄层色谱法检测可知含有部分紫外不显色、极性大于绿原酸的杂质，这些杂质影响绿原酸的纯化结晶，所以该体积比乙醇-乙酸乙酯不作具体考察。通过高效液相色谱法“1.3.3”节检测分析萃取体系上下相中绿原酸峰面积、杂质分配情况、萃取率等，实验结果如表2[9]所示：

表2 不同体积比的乙醇-乙酸乙酯对绿原酸萃取效果Table 2 The results of different volume ratio of ethyl acetate and methanol on chlorogenic acid

根据表2可知：随着乙醇-乙酸乙酯中乙醇体积比的增加，绿原酸在有机相中的含量逐渐增大。同时，杂质在上下相中的比例也在不断增大。以杂质1和杂质2为例，当乙醇-乙酸乙酯体积比为12∶88和15∶85时，杂质1和杂质2在上相中增幅较大。大量杂质会对绿原酸的纯化结晶过程造成较大影响。因此，选择乙醇-乙酸乙酯(9∶91)作为作为萃取溶剂。等体积萃取8次时，绿原酸在上下相中达到平衡。在常温常压条件下，合并8次萃取液共400mL，分成4等份，分别通过2，3，4，5g的活性炭吸附脱色。

综合考虑脱色效果及对绿原酸的吸附量，活性炭用量为0.03g·mL-1时效果较好。脱色后的乙醇-乙酸乙酯萃取液经减压蒸馏浓缩得到绿原酸粗品，再用V(乙酸乙酯)∶V(甲醇) =3∶2混合溶剂重结晶得到白色粉末状绿原酸晶体。

2.3 重复试验

取100 mL金银花浸膏水溶液，用等体积乙酸乙酯萃取6次以去除杂质，于金银花浸膏水溶液中加入8g硫酸铵，搅拌至溶解，再用等体积V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=9∶91萃取8次，合并8次萃取液共800mL，通过装入量为24g的活性炭柱吸附脱色，脱色后萃取液经减压蒸馏得绿原酸粗品约2.95g，经V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=3∶2溶剂重结晶得2.05g绿原酸晶体，最终产物纯度为98.63%，金银花浸膏水溶液中绿原酸含量为2.8%，萃取率为36.63%。

2.4 结构鉴定

分离得到白色结晶，其MS、IR、1HNMR、CNMR等各项数据如下：

mp:208～209℃，分子式为C16H18O9，分子量为354。IR (KBr) v/cm-1:3355，2954,2925,2985,2360,2341,1727,1704,1687,1639,1384,1288,1186,1085,816。1HNMR(DMSO-d6, 300 MHz)，δ:7.45(1H,d,J=15.6Hz,H-β),7.04(1H,d,J=1.8Hz,H-2′), 6.98(1H,dd,J=8.4,1.8Hz,H-6′), 6.77(1H,d,J=8.4Hz,H-5′),6.15 (1H,d,J=15.6Hz,H-α),5.07(1H,m,H-3),4.78(1H,m,H-5),3.56(1H,dd,J=8.4,3.0Hz,H-4),2.06～1.757(4H,m,H-2,6)。13CNMR(DMSO-d6,300 MHz)，δ:175.4(COOH),166.2(C=O),148.8(C-β),114.73(C-α),126.0(C-1′),121.8(C-2′),145.4(C-3′),148.8(C-4′),115.2(C-5′), 121.8(C-2′), 73.92 (C-1), 37.6(C-2), 71.3(C-3), 70.8(C-4),68.5(C-5),36.7(C-6)。

3 结语

通过乙醇-乙酸乙酯混合有机溶剂选择性萃取技术替代传统的柱层析分离方法，达到了富集绿原酸的目的，然后再通过活性碳吸附除杂和重结晶即得到了绿原酸，其纯度达到98.63%，且萃取率为36.63%。此方法建立一种液液萃取法分离高效分离绿原酸的方法，与传统柱色谱法相比，生产成本低、工艺简单，有利于工业生产。