延胡索叶不同发育期总生物碱含量测定

赵永钦，成余勤，岑巧梦，邵敬宝，马美兰，石森林*

(1.浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州 310053； 2.东阳市农业技术研究所，浙江 东阳 322100)

延胡索为罂粟科植物延胡索(Corydalisyanhusuo)的干燥块茎。在传统医学中有两千多年的应用历史，主要用于胸痹心痛、脘腹疼痛、腰痛、疝气痛、痛经、闭经、产后瘀滞腹痛、跌打损伤等治疗[1]，为中药复方制剂中的常用药。延胡索原主产于浙江，引种至陕西汉中至今约有40年历史，到目前已发展成为延胡索主产区之一[2]。研究表明，延胡索地上部分的药效成分和地下茎的差别很大，主要为阿朴啡型生物碱，如O-甲基南天竹碱、海罂粟碱、1-甲基乙基-3，4，6，7-四甲氧基菲、去甲海罂粟碱和β-谷甾醇[3]。O-甲基南天竹碱具有抑制中枢神经[4]、止咳平喘[5]、麻痹[6]的作用；海罂粟碱及去甲海罂粟碱具有抗炎镇痛[7-9]、扩张支气管[10]、抗肾上腺素[11]、阻断钙离子通道活性[12]的作用；β-谷甾醇具有降胆固醇[13-14]、抑制肿瘤[15-16]和修复胃粘膜[17]的作用；1-甲基乙基-3，4，6，7-四甲氧基菲其具体药理作用研究较少。目前针对延胡索块茎生物碱指纹图谱、提取纯化工艺以及药理活性研究文献报道较多[18-21]，关于叶总生物碱的研究只有零星报道[22]。延胡索块茎生物碱与叶生物碱均为异喹啉生物碱，可能具有与块茎生物碱相似的活性。在延胡索栽培过程中，延胡索叶一般以农业废弃物处理，既造成资源浪费，也加大了环保压力。随着对传统非药用部位资源化学成分的深入研究，部分传统非药用部位的潜在资源价值逐渐显现，并越来越引起人们的高度重视。已有研究表明，延胡索地上部分生物碱成分均为阿朴啡型，与地下块茎差别较大，可能具有与块茎不同的药理活性。关于不同生育期延胡索叶总生物碱变化的研究鲜见报道。本研究在建立了紫外分光光度法测定延胡索叶总生物碱含量方法的基础上，进一步分析两年间不同生长发育时期延胡索叶的次生代谢产物动态积累规律，研究浙江道地药材延胡索叶不同生长发育期生物碱类次生代谢产物积累规律，确定最佳采收期，为道地产区延胡索叶GAP种植、质量控制及临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

延胡索叶于2017—2019年采自浙江中医药大学药学院“浙八味”研究所试验田，经石森林教授鉴定为罂粟科植物延胡索(Corydalisyanhusuo)的干燥叶片，洗净、杀青、烘干备用。鉴于延胡索叶的生长发育规律和生物量，采样分以下5个时期进行：叶盛发期(3月16日)、开花初期(3月23日)、开花盛期(3月31日)、开花末期(4月8日)、叶衰老期(4月16日)。

1.2 试剂

延胡索乙素对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，含量99.86%，批号MUST-18032720)；无水乙酸钠(批号20160315)、无水硫酸钠(批号2016092901，成都科龙化工试剂厂)；溴甲酚绿(批号20160817，广东精细化学品工程技术研究开发中心)；氯仿分析纯(成都科龙化工试剂厂)；甲醇为色谱纯(美国Tedia公司)；其他试剂均为分析纯(成都科龙化工试剂厂)。

1.3 试验仪器

UV-Vis 2450型紫外-可见分光光度仪(日本岛津公司)；DFY-500高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；XS105 DualRange型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；JA2003N电子天平(上海精密仪器有限公司)；MAS-Ⅱ Plus型常压微波提取器(上海新仪微波化学科技有限公司)；FE20 pH计(瑞士梅特勒-托利多公司)；Millipore Synergy超纯水系统(美国密理博公司)。

1.4 溶液的制备

对照品溶液的制备。精密称取延胡索乙素标准品适量，用甲醇定容至50 mL容量瓶中，即得187.60 μg·mL-1的延胡索乙素对照溶液。

供试品溶液的制备。精密称取0.500 g延胡索叶粉末，测定含水量后，置于100 mL的微波提取器中，加入50 mL pH为3.0的醋酸盐缓冲液，在70 ℃ 350 W的微波条件下提取20 min，冷却后进行抽滤，精密移取10 mL的续滤液，用浓氨水调节pH至8.0，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于蒸发皿中，在80 ℃条件下减压旋转蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，即得供试品溶液。

1.5 显色方法和测定波长选择

1.5.1 显色试验

依次在分液漏斗中加入12 mL pH为4.5的缓冲液，3 mL溴甲酚绿溶液，1 mL样品及9 mL氯仿，振荡均匀，静置半小时后，将氯仿层放于盛有0.4 g无水硫酸钠的10 mL离心管中。

1.5.2 波长选择

取显色后的延胡索乙素对照品溶液与供试品溶液，以氯仿为空白参比溶液，在200～600 nm波长扫描，在411 nm处标准品与供试品均具有最大吸收峰，故选择测定波长为411 nm。

1.6 延胡索乙素标准曲线的制备

精密吸取1.4节中配制的对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL，置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，进行显色试验，在411 nm处测定吸光度；以延胡索乙素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.005 2X-0.019 09(R2=0.999 8，n=6)。结果表明，延胡索乙素在18.760～187.600 μg·mL-1范围内吸光度与浓度的线性良好。

1.7 精密度、稳定性、重复性试验

取1.4节中配制的对照品溶液，进行显色试验后，在同一条件下连续测定6次，测得相对标准差为0.12%，表明方法精密度良好。

1.4节中配制的对照品溶液进行显色试验，在411 nm波长处每隔20 min测定1次吸光度，连续测定6 h，测得相对标准差为0.3%，表明显色后的延胡索乙素在6 h内稳定性良好。

按1.4节方法处理供试品，平行制备6份，进行显色试验，在411 nm处测定吸光度，测得相对标准差为1.90%。结果表明，试验的重复性良好。

1.8 加样回收试验

精密称定9份延胡索叶片粉末0.25 g，分别置于100 mL的微波提取器中，分别加入样品总碱含量的80%、100%、120%延胡索乙素标准溶液，显色后，在411 nm处测定吸光度。

1.9 不同发育期延胡索叶生物碱含量测定

精密称取不同发育期的延胡索叶片粉末0.5 g，平行3份，测定含水量，置于100 ml的微波提取器中，按1.4节方法制备供试品溶液，在411 nm处测定吸光度，计算总生物碱含量，试验处理及数据测定均重复3次，取其平均值，方差分析均采用SPSS 13.0统计软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 回收率

表1显示，平均加样回收率为99.2%，相对标准差为3.0%，表明加样回收率良好。

2.2 不同发育期延胡索叶生物碱含量

表2显示，延胡索叶总生物碱连续2年含量动态变化呈整体下降趋势，即从叶盛发期到叶衰老期，总生物碱含量逐渐降低，尤其初花期到盛花期下降显著。

表1 样品的回收情况

表2 不同发育期延胡索叶总生物碱含量变化

3 讨论

随着对传统非药用部位资源化学成分的深入研究，部分传统非药用部位的潜在资源价值逐渐显现，并越来越引起人们的高度重视，如银杏叶、杜仲叶等逐渐演化为药用，成为中药体系中的新增品种。人参茎叶、花、果序等均含有与人参相似的资源性化学成分，具有较高的药用及保健价值。开发利用使人参各组织部位的资源价值得到充分释放，人参资源经济产业链得到有效延伸。黄芩茎叶、地黄茎叶均已开发形成成药，并实现产业化[23-24]。研究显示，在延胡索叶生长发育过程中，某些时期总生物碱含量可达20 mg·g-1以上，几乎与延胡索块茎生物碱含量相当，这为延胡索叶开发入药提供了物质保证。

中药材有效成分多为次生代谢产物，不仅与植物所处的生长发育时期有关，而且是与环境相互作用的产物，在植物提高自我保护和生存竞争能力、协调与环境关系上充当着重要角色，其产生和变化比初生代谢产物与环境有着更强的相关性[25]。由于延胡索是多年生的草本植物，各生育阶段是连续不断且相互重叠的。可将延胡索的生长发育阶段简单分为块茎萌芽期、叶初发期、叶盛发期、开花初期、开花盛期、开花末期、叶衰老期、块茎休眠期八个时期，考虑后期资源开发利用，本研究只对中间几个关键时期叶总生物碱含量进行了含量测定，至于不同时期总生物碱成分的差异仍需进一步研究。

生物碱是植物长期生态环境适应过程中形成的一类次生代谢产物。由于次生代谢产物含量只有在初级代谢中间产物积累到一定程度并在调节次生代谢的酶促作用下才会出现高峰[26]。叶盛发期、开花初期这2个时期由于光照充足，雨量充沛，光合作用的速率较高，因此，延胡索生长迅速，代谢旺盛。此时也容易遭受食草动物、微生物侵害，所以生物碱等次生代谢产物需要维持较高水平。延胡索作为夏季休眠的多年生植物，生长进入盛花期后期，光照强度增加和日照时间延长，地下块茎快速膨大，体内累积的物质开始分解、转化，叶片中生物碱等次生代谢产物含量不断降低转移至块茎中。本研究表明，延胡索叶片总生物碱含量随植株的生长发育而波动，而浙江传统采收期(5月上旬)的生物碱含量最低。因此，针对不同生长发育期延胡索的次生代谢产物积累变化的研究是必要的。