乌蕨抗炎活性部位研究

王亚敏 廖卫波 陈乐 黄斌 胡燕珍

（江西省中医药研究院 南昌330046）

乌蕨[Stenoloma chusanum(L.)Ching]来源于陵齿蕨科乌蕨属植物全草[1]，在民间素有“万能解毒药”之美称[2]。民间验方显示，乌蕨具有消炎止痛、治疗肾盂肾炎的功效[3]。现代研究发现乌蕨具有抗炎作用，乌蕨提取物能有效降低二甲苯致小鼠耳肿胀，明显降低小鼠腹腔毛细血管通透性，明显降低炎症因子（COX-2、PGE2、TNF-α、NO）的浓度[4]。乌蕨总黄酮及水煎液具有一定的抗炎活性，均能抑制二甲苯致小鼠耳肿胀[5]。乌蕨乙酸乙酯萃取物及水提取剩余物对大鼠急性咽喉炎有改善作用[6]。目前，乌蕨的抗炎活性研究仅限于水和醇提取物体内动物实验研究，并未见不同浓度乙醇洗脱部位体外抗炎效果比较的研究报道。本研究比较不同浓度乙醇洗脱物对RAW264.7 细胞活力及对LPS 诱导RAW264.7细胞炎症模型的影响，以期诠释乌蕨抗炎物质基础，筛选抗炎有效部位，为开发抗炎活性单体化合物奠定基础，为乌蕨的资源开发利用、质量标准的建立提供参考。现报道如下：

1 仪器、材料、试剂与方法

1.1 仪器 RE52-98 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），MS105Du 电子分析天平（梅特勒托利多仪器上海有限公司），DHG-9101-2SA 电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司），HBS-1096A 酶标分析仪（南京德铁实验设备有限公司）。

1.2 材料及试剂 DMEM 培养基（GibcoBRL 公司），脂多糖（Sigma Chemical 公司），胰蛋白酶（GibcoBRL 公司），胎牛血清（GibcoBRL 公司），小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（上海远慕生物科技有限公司），青霉素链霉素双抗液（上海远慕生物科技有限公司），乙醇（广东光华科技股份有限公司），乌蕨（我院中药资源普查队员采集鉴定）。

1.3 实验方法

1.3.1 乌蕨不同浓度乙醇洗脱部位的制备 乌蕨5 kg 粉碎，在常温下，先后用95%乙醇、75%乙醇各浸提3 次，减压浓缩，合并浸膏，再经MCI 柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩得到不同浓度乙醇洗脱部位（分别标记为A1、A2、A3、A4、A5）。

1.3.2 乌蕨乙醇洗脱部位对RAW264.7 细胞活力的影响 将贴壁对数生长期RAW264.7 细胞，以7×104个/孔接种于96 孔板中，依次加入不同浓度（150、300、600 μg/ml）的乌蕨洗脱物100 μl；同时设置对照组，每组设5 个平行孔，于5%CO2培养箱中培育24 h 后，每孔加现配的MTT 溶液（5 mg/ml）10 μl，继续培育4 h，弃上清液，每孔加入100 μl 的DMSO 溶液，振摇20 min，用酶标仪于570 nm 波长处测定吸光度，计算细胞生长存活率。细胞存活率＝（A 药物组－A 溶剂剂）/（A 对照组－A 溶剂剂）×100%。

1.3.3 乌蕨乙醇洗脱物对LPS 诱导的RAW264.7细胞炎症的影响 将贴壁对数生长期RAW264.7细胞，以7×104个/孔接种于96 孔板中，依次加入不同浓度（150、300、600 μg/ml）的乌蕨醇洗物（水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）各100 μl，培育4 h 后，加入终浓度为1 μg/ml 的LPS 溶液。同时设置空白对照组、LPS 组、LPS+乌蕨醇洗脱物（水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）组，每个浓度组设3 个平行实验，培育20 h，每孔加现配的MTT 溶液（5 mg/ml）10 μl，继续培育4 h，弃上清液，每孔加入100 μl 的DMSO 溶液，振摇20 min，用酶标仪于570 nm 波长处测定吸光度。

1.4 统计学方法 数据处理采用SPSS19.0 统计学软件。

2 结果

2.1 乌蕨醇洗脱物对RAW264.7 细胞活力的影响利用MTT 法评价乌蕨各醇洗脱物对小鼠RAW264.7巨噬细胞活力的影响。与对照组相比，乌蕨各洗脱物（水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）在（150～600 μg/ml）浓度范围内，细胞存活率均在90%以上；乌蕨洗脱物（水、30%乙醇、95%乙醇）在（150～600 μg/ml）浓度范围内，细胞存活率在95%以上；乌蕨50%乙醇洗脱物、乌蕨70%乙醇洗脱物在浓度为600 μg/ml 时细胞存活率略低。见图1。本研究选取细胞存活率在95%以上的洗脱物浓度用于后续实验。

图1 乌蕨醇洗脱物对RAW264.7 细胞活力的影响

2.2 乌蕨醇洗脱物对LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症的影响 与LPS 组相比，乌蕨各醇洗脱物均能改善LPS 诱导RAW264.7 巨噬细胞的炎症反应，且有一定的浓度依赖性；乌蕨洗脱物（50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）能明显改善LPS 诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应，差异有统计学意义（P＜0.01）；乌蕨洗脱物（水、30%乙醇）在浓度150 μg/ml时对LPS 诱导RAW264.7 巨噬细胞的炎症反应较弱，差异无统计学意义（P＞0.05）。（50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）乌蕨洗脱物对LPS 诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应明显优于（水、30%乙醇）乌蕨洗脱物，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

图2 乌蕨醇洗脱物对LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症的影响

3 讨论

本研究采用MTT 法评价细胞存活率，采用LPS 诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 建立的炎症模型，评价乌蕨各醇洗脱物的抗炎活性，结果显示乌蕨（50%、70%、95%）醇洗脱物具有显著的降低LPS 诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 炎症反应的作用；前期实验显示乌蕨水、30%乙醇洗脱物量最少，而乌蕨50%、70%乙醇洗脱物量最多，（水、30%乙醇）乌蕨洗脱物与（50%、70%乙醇）乌蕨洗脱物在抗炎活性方面有显著性差异，因此推测50%、70%乙醇洗脱物为乌蕨最有效抗炎活性部位。本研究中乌蕨50%、70%醇洗脱物在浓度600 μg/ml 时细胞存活率低于95%，所以未对这个浓度进行后续实验。

综上所述，本研究对乌蕨抗炎有效部位进行了系统性研究，可为后期抗炎有效单体成分的开发奠定基础，为乌蕨临床应用及质量标准的建立提供依据。