石菖蒲乙醇提取物对15 种病原真菌抑菌活性研究

李少华，谷晓杰，安丽，何晓婷，曹挥*

（1.太原学院，山西太原030001；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

随着人们对食品、环境安全的关注，农业安全生产及农产品安全成为当前最重要的热点问题。因缺乏有效的绿色防控方案和绿色安全农药，化学防治仍是当前作物病虫害防治的重要手段，制约了农业产业的安全健康发展。从植物中寻找高效安全的新型农药，一直是植保领域的研究重点。

石菖蒲（Acorus gramineus），属天南星科，别名九节菖蒲、菖蒲、菖草等［1］，生长于海拔 20～2 600 m 的地区，主要分布于亚洲，以根部入药，其味辛性温，具有保护神经细胞、抗癌、抗惊厥、抗心律失常、抗病虫害等作用［2］，其化学成分可分为挥发性成分和非挥发性成分［3］。挥发油是石菖蒲的主要有效成分，主要有β-细辛醚、α-细辛醚、甲基异丁香酚榄香素等［4］；非挥发性成分主要包括生物碱类，兹醇类，醌和酮类，醛和酸类，氨基酸类及糖类等［5］。其中β-细辛醚的药理研究揭示，具有抗肿瘤、抗炎，保护心肌组织、保护呼吸和消化系统，杀虫灭菌等作用［6～9］，在中枢神经系统影响方面，具有良好的抗老年痴呆、抗癫痫、抗抑郁作用［10］。

在杀虫抑菌方面，石菖蒲乙醇提取物对番茄灰霉孢子萌发的抑制效果显著［11］，且温室防效良好。黄衍章等［12］发现菖蒲烯酮对玉米象和谷蠢具有很好的熏蒸活性。谢红英等［13］研究发现石菖蒲的甲醇提取物对粘虫具有极强的拒食和生长发育抑制作用，兼具一定触杀活性。

本试验研究了石菖蒲提取物对15 种植物病原菌的抑菌活性，旨在为植物病害的安全防治提供新的依据，同时为充分利用我国丰富的植物资源为植物源农药的开发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试植物

供试植物为石菖蒲根，购自河北省安国药材市场，产地为江西吉安市泰和县。

1.1.2 供试菌种

梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria）、核桃枯梢病菌（Phomopsis macrospora）、甜瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、兰花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、番茄枯萎病病原菌（Phomopsis macrospora）、三七根腐病菌（Cylindrocaipon destructans）、苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidies）、葡萄根腐病菌（Fusarium oxysporum）、茄子 枯萎病 菌（Fusarium oxysporum）、枣炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidies）、番茄灰霉病病原菌（Botrytis cinerea）、番茄早疫病病原菌（Alternaria solani）、番茄黑斑病病原菌（Pseudomonas syringae）均由山西农业大学农学院植物病理实验室提供。

1.1.3 仪器和试剂

试剂：马铃薯葡萄糖琼脂培养基，95%乙醇。

仪器：1702-MP8 型电子天平（上海拓衡实业有限公司）、SW-CJ-1D 型单人净化工作台（苏州普爱德净化设备科技有限公司）、100～1000 μL移液枪（济南鑫贝西生物技术有限公司）、恒温培养箱（上海皓庄仪器有限公司）、立式自动压力蒸汽灭菌器（立德泰勀科学仪器有限公司）、成像显微镜（深圳长欣自动化设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 植物粗提物的制备

将石菖蒲根烘干粉碎，过60 目筛，按提取物干粉和 95% 乙醇=1∶5（m∶v）装入广口瓶，浸泡 24 h后，30 ℃超声波萃取1 h，用循环水式真空泵抽滤；将抽滤液减压浓缩至一定浓度，室温下保存备用。

1.2.2 抑菌活性测定

抑菌活性采用菌丝生长速率法［14］测定。

取1 mL 浓度为40 g·L-1石菖蒲乙醇提取物加入 19 mL 的 PDA 培养基中，配制成浓度为 2 g·L-1的加药培养基，以加入等体积的无菌水作为空白对照，每个处理重复3 次。用直径为0.7 cm 的打孔器在培养4d 的生长旺盛的供试菌株上打取菌饼，将菌饼接种在加药培养基与空白对照的培养基中，置于28 ℃的培养箱中培养。采用十字交叉法测定菌落直径，并在96 h 拍照观察石菖蒲提取物处理不同病菌后菌落的形态变化。

1.2.3 石菖蒲乙醇提取物对苹果炭疽病的毒力测定

采用二倍稀释法将石菖蒲乙醇提取物配制成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 g·L-16 个浓度梯度，测定其对苹果炭疽病的抑制作用，并计算EC50。

1.2.4 石菖蒲乙醇提取物对菌丝形态的影响

参照沈晓强等［15］的方法，将石菖蒲提取物配制成浓度为1 g·L-1的含药培养基，接种振荡培养（150 r·min-1，28 ℃）96 h 后观察菌丝形态。

1.3 数据分析

将收集的数据利用Excel 2013 和DPS 软件分别计算抑菌率及进行毒力分析。

2 结果与分析

2.1 石菖蒲乙醇提取物对15 种病原菌的抑菌活性

试验测定了质量浓度为2 g·L-1的石菖蒲乙醇提取物对梨黑斑病菌、三七根腐病菌、和苹果炭疽病菌等15 种病原菌的抑菌活性，在96 h 石菖蒲乙醇提取物对15 种病原菌的菌丝抑制率达到80%的有5 种。其中以对苹果炭疽病菌的抑制效果最好，可达到94%；对核桃枯梢病菌次之，抑制率为92%，抑菌效果稳定（表1，图1）。

2.2 石菖蒲乙醇提取物对苹果炭疽病原菌的毒力作用

石菖蒲对苹果炭疽病菌的抑制效果随着石菖蒲浓度的减少而降低（表2）。选取96 h 的抑菌数据运用DPS 软件进行统计分析可得，毒力方程为y=6.054 3+1.934 7x。 其 中 EC50为 0.29 g·L-1，相关系数是0.980 6。

2.3 石菖蒲提取物对菌丝形态的影响

将培养好的菌丝在成像显微镜下观察（图2）。无处理的苹果炭疽病菌菌丝生长正常，菌丝体饱满，无色，无隔膜，且分枝较长；而石菖蒲处理过的菌丝明显受到了抑制，生长缓慢，分叉增多，并且分枝很短，菌丝生长杂乱。

3 讨论与结论

从植物中寻找绿色安全的植物源农药一直是当前研究的热点，石菖蒲为我国传统中药，本研究发现其提取物对15 种病原菌的均有不同程度的抑制作用，其中，对苹果炭疽病菌的效果极为显著，96 h 抑制率达到94%，抑制中浓度 EC50值为0.29g·L-1。此外，从用提取物处理后菌丝的形态显微观察，也可以明显地看到石菖蒲提取物处理过的苹果炭疽病菌菌丝生长缓慢，分叉增多，分枝变短，这也进一步证明了石菖蒲提取物的抑菌效果。

表1 石菖蒲乙醇提取物对15 种病菌菌丝生长的抑制作用Table1 Inhibitory effect of ethanol extract of A.tatarinowii against 15 species of pathogens

图1 15 种病原菌在96 h 的菌丝生长图Fig.1 Hyphal growth diagram of 15 pathogens at 96 h

从试验结果来看，石菖蒲提取物中含有广谱性的抑菌活性成分，Lee 等研究表明，石菖蒲中对白粉菌等病原起抑制作用的活性成分主要是α-细辛醚和细辛醛［16］，但白粉菌为子囊菌亚门的真菌，而本试验所用真菌基本为半知菌亚门真菌，是否为同一成分在起作用，需要进一步验证。

表2 不同浓度石菖蒲对苹果炭疽病菌菌丝的抑制作用Table2 Inhibitory effect of ethanol extract of A.tatarinowii against growth of C.Gloeosporioidies

图2 石菖蒲提取物对菌丝形态的影响（40×）Fig.2 Effect of A.tatarinowii extract on mycelium morphology（40×）

杀菌剂对细胞壁的作用大多是响细胞壁的形成，达抑制或杀灭真菌的目的［17］。因此大多药物处理真菌菌丝后，菌丝会发生破裂，原生质渗漏，如从心黎等曾报道过YX 拟青霉菌发酵浓缩物引起马铃薯晚疫病菌菌丝扭曲、破裂、分枝增多、菌丝膨大［17］。而本研究中，石菖蒲提取物处理苹果炭疽病菌菌丝后，并无明显的菌丝破裂，只是表现明显的生长受抑和菌丝变短、分枝增多。真菌菌丝丝状生长是高度专一性的顶端生长，其中几丁质扮演了重要角色。几丁质是真菌细胞壁的主要成分，在真菌菌丝体顶端细胞中含有其合成酶体，它会源源不断的运送几丁质合成酶到菌丝尖端细胞壁表面，使该处不断合成几丁质微纤维，从而保证菌丝不断向前延伸［18］。本研究中菌丝的生长受阻，不能向前延伸，分枝增多，可能是抑制了几丁质合成酶的产生，导致细胞壁上纤维原的结构发生变形所致，相关结果需进一步研究。

与化学农药相比，植物源农药来源于自然，具有对生态环境友好、无污染、不易产生抗药性、且生产原料广泛等特点和优点，应用前景广阔。本研究结果证明了石菖蒲提取物有很好的室内抑菌活性，有待进一步田间试验和农药的开发。