复合促生菌株筛选及其对油菜、黄瓜幼苗的促生效果

张 亮，盛 浩，谭 丽，袁 红，易建平，邓立平

（1.湖南农业大学资源环境学院，湖南 长沙 410128；2.醴陵市农业农村局土壤肥料工作站，湖南 醴陵 412200；3.醴陵市农业农村局，湖南 醴陵 412200；4.醴陵市农技推广中心，湖南 醴陵 412200）

化肥和农药在现代农业生产中发挥着重要作用，然而随着化肥与农药使用量的逐年增加，其残留物对环境造成了巨大危害。在提倡高产、高效、绿色农业的大背景下，高效、复合型促生菌的研究与应用为寻求传统化肥、农药替代产品以及修复受损土壤环境指明了方向。根际促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）泛指一类自由生长在根际土壤环境中或根系内部，并具有促进植物生长或增加作物产量、抑制病虫害能力的根际细菌，其对克服土壤逆境、改善微生态环境具有特殊意义[1]。目前为止，国内外已经发现的具有防病促生潜能的根际微生物有20多个种属，包括根瘤菌、沙雷氏属、荧光假单孢菌、芽孢杆菌等[2]。上述根际促生菌对于植物的促生机制主要包括合成对于植物生长发育有直接促进作用的物质[如吲哚乙酸（IAA）等植物激素]、改变元素形态促进植物对于养分的吸收等（如固氮、解磷）[2-8]；然而，大多数菌株在克服养分、病害逆境时功能较为单一；因此，筛选获得具有复合能力的促生菌株，对高效改善根际营养与调控土壤微生态环境具有非常重要的意义。

油菜（Brassica napusL.）和黄瓜（Cucumis sativusL.）均为我国大面积种植作物，特别是油菜，因其花期之前可作菜用，花期之后籽粒可榨油而具有“油—菜兼顾”之特色，在我国蔬菜和食用油领域占有重要地位[9]。本研究以稻—油不同轮作条件下的耕层土壤为样本，拟通过选择性培养方法获得兼具固氮、解磷以及产IAA能力的复合型高效促生菌株，并通过盆栽试验对其促生效果予以验证。本研究不仅能够为蔬菜种植养分培育资源的更广阔替代利用提供优良促生菌株材料，还可以从可培养耕层土壤促生菌数量的角度揭示稻—油轮作制度对地力生态功能维护的优势。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试土壤与种子

土壤为稻—油轮作与稻—稻轮作耕层土壤，位于湖南浏阳的农大稻—油轮作试验田。

油菜品种为常杂油菜3号，购于湖南省农业科学院湘科种苗集团。黄瓜品种为蔬研十号，购于湖南兴蔬种业有限公司。

1.1.2 培养基

肉汤酵母培养基（NBY）：营养肉汤粉8 g，酵母提取物2 g，磷酸氢二钾2 g，磷酸二氢钾0.5 g，葡萄糖2.5 g，1 mol/L七水合硫酸镁1 mL，去离子水1 L，琼脂15 g，pH值7.5。

固氮培养基（阿须贝培养基+无N培养基）：苹果酸2 g，三水合磷酸氢二钾0.5 g，七水合硫酸镁0.2 g，氯化钠0.1 g，二水合氯化钙20 mg，钼酸钠2 mg，氢氧化钾4.5 g，5%溴百里酚5 mL，维生素H 10 mg，琼脂15 g，去离子水1 L，pH值7.5。

解磷培养基：葡萄糖10 g，磷酸钙5 g，六水合氯化镁5 g，七水合硫酸镁0.25 g，氯化钾0.2 g，硫酸铵0.1 g，琼脂15 g，去离子水1 L，pH值7.0。

液体LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，去离子水950 mL，pH值7.0。

IAA检测培养基为胰蛋白胨大豆肉汤培养基：胰蛋白胨17 g，植物蛋白胨3 g，氯化钠5 g，磷酸氢二钾2.5 g，葡萄糖2.5 g，色氨酸100 μg/mL，最终pH值7.3±0.2。

1.2 试验方法

1.2.1 复合促生菌株筛选试验

土壤可培养细菌分离采用连续稀释法，具体步骤为：称取10 g土壤于置有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，振荡摇匀30 min（180 r/min），静置5 min，分别吸取1 mL悬液加入置有9 mL无菌水的灭菌试管中，后依次连续稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同浓度，吸取不同浓度混合液100 μL并涂布于NBY培养皿中，于25 ℃条件倒置培养于生化培养箱中。

菌株纯化：每隔12 h观察上述培养皿生长情况，待菌落生长至适合形态时，用接种棒挑取单菌落划线至NBY培养皿，25 ℃条件倒置培养于生化培养箱培养，备用。

促生菌初筛：分别将纯化后的菌株接种于固氮、解磷培养基，室温条件培养，每隔12 h观察菌株生长情况，在2种固氮培养皿上同时可以良好生长的菌株记为固氮菌，在解磷培养基上可观察到清澈透明圈的菌株记为解磷菌，所有记号菌株均另划线接种至新NBY培养皿、编号、室温培养3 d，后转至4 ℃低温保存，备用。

促生菌复筛：将疑似菌株重复进行固氮解磷培养试验，以检验效果是否准确，同时将疑似固氮解磷菌株分别接种至含有5 mL液体LB培养基的10 mL试管中，于170 r/min，28 ℃条件下振荡培养48 h，后加入Salkowsky生长素显色试剂，观察显色反应，确定其产IAA能力强弱，如显粉红色则为产生长素菌株，记号并进行生长素定量检测。

IAA定量检测[10]：接种于IAA检测培养基的各生防菌株在24 ℃、150 r/min条件下振荡培养48 h后，经12 000 r/min离心10 min，1 mL菌悬液加入2 mL Salkowsky试剂并混匀，于28 ℃培养30 min后得到粉色显色，并在530 nm条件下进行比色，以10～100 μg/mL的标准IAA稀释液设置标准曲线，单位表示为μg/mL。

1.2.2 盆栽促生试验

采用人工气候箱培育油菜和黄瓜幼苗，具体步骤为：（1）土壤（过2 mm筛风干土）装杯；（2）供试促生菌经纯化后接种于100 mL NBY液体培养基振荡培养48 h，备用；（3）将形态一致的油菜种子、黄瓜种子分别于各菌株发酵液中浸种10 min，后均匀播种于上述土杯中（每杯5粒），并将剩余菌液倒入各处理土壤，以清水作为对照；（4）培养于人工气候箱中。培养条件：28 ℃光照16 h+16 ℃无光8 h。

试验设无菌对照处理和已筛选出的不同复合菌株处理，各处理重复10杯，日常管理。10 d后观察记录不同处理油菜、黄瓜幼苗植株鲜质量、根长、株高等生长指标。

2 结果与分析

2.1 固氮、解磷菌株初筛结果

从表1可以得出，筛选并纯化处理后，最终获得稻—稻轮作土壤中可分离菌株194株，稻—油轮作土壤中可分离菌株208株。

通过选择性培养基专性生长培养法，初步筛选共获得固氮菌73株，其中稻—稻轮作土壤获得35株，稻—油轮作土壤获得38株；解磷菌38株，其中稻—稻轮作土壤获得3株，稻—油轮作土壤获得35株（表1）。

表1 固氮、解磷菌株筛选结果 株

2.2 固氮、解磷菌株复筛验证

通过对比2种不同种植制度中所获解磷菌与固氮菌编号（图1、图2）发现，同时兼具解磷与固氮效果的复合菌株编号为：59、69、79号（稻—稻）；6、7、14、107、110、111、112号（稻—油）。

2.3 复合型固氮解磷菌产IAA能力定量检测

通过对兼具固氮与解磷特性的复合菌株进行产IAA能力定量检测后发现，DD-69、DD-79、DY-6、DY-7、DY-111、DY-112具有较强的IAA分泌能力（＞10 μg/mL），其浓度范围为10.09～12.59 μg/mL（表2）。

2.4 盆栽促生实验结果分析

如表3所示，与对照相比，筛选出的6株复合型促生菌对油菜和黄瓜幼苗早期株高的生长普遍具有显著的促进效果，其增幅分别为25.45%～111.96%和4.45%～18.22%，以DD-69最佳；促生菌DY-6与DY-7菌株对油菜幼苗早期根系生长具有一定促进效果，DD-79、DY-111菌促生效果均不显著；促生菌DD-69与DY-111对黄瓜幼苗早期根系生长具有一定促进效果，且与CK和其他菌株差异显著；促生菌对油菜幼苗早期鲜质量的影响差异不显著，但促生菌DY-6和DD-79对黄瓜幼苗早期鲜质量具有显著促生效果。

表2 产IAA能力检测结果（部分菌株）

3 结论与讨论

本研究通过选择性培养基分离等传统微生物技术对稻—稻轮作与稻—油轮作制度下耕层水稻土壤中的促生细菌进行了分离与筛选工作，结果表明稻—稻轮作耕层土壤中分离获得194个菌株，其中含固氮菌35株、解磷菌3株；稻—油轮作耕层土壤中分离获得208个菌株，其中含固氮菌38株、解磷菌35株。复合验证结果显示，兼具固氮、解磷以及较强生长素分泌能力的促生菌株共6株，分别为DD-69、DD-79、DY-6、DY-7、DY-111、DY-112，其IAA分泌浓度为10.09～12.59 μg/mL。经人工气候箱培育试验发现，获得的6株复合型促生菌普遍对油菜和黄瓜早期幼苗株高生长具有一定的促生效果，尤其是有利于幼苗株高的生长。

根际促生菌（PGPR）是一类根际环境友好型微生物，具有改善土壤理化性质、提高土壤肥力、抑制病虫害发生等重要农业利用属性[11]。对复合型高效促生菌的筛选是获得这类有益微生物的必然途径。本研究以稻—稻、稻—油等不同轮作制度的耕层水稻土壤为筛选材料，通过传统微生物分离技术，对其中的固氮菌、解磷菌以及生长素代谢菌等可培养功能细菌进行了分离与筛选，并经复筛与盆栽试验对获得的6株复合型促生菌株的促生效果予以了明确。这与前人[11]有关固氮、解磷菌促进作物生长的试验结果一致。本研究中6株促生菌虽对油菜幼苗和黄瓜幼苗的早期生长具有一定促进效果，但对根系的促生效果普遍不够显著（DD-69和DY-111除外），这可能与接种剂量以及容重等土壤理化性状有关[12]。此外，本研究结果还显示出稻—油轮作制度下耕层水稻土壤中的可分离细菌以及具有固氮、解磷、产IAA能力促生菌可筛选数量明显高于稻—稻轮作制度的种植土壤，从根际有益微生物的角度佐证了稻—油轮作制度对作物根际土壤生态环境的积极作用。

表3 促生菌对油菜、黄瓜幼苗生长的促进效果