超声辅助乙醇提取海带多酚工艺优化及抗氧化活性

苏艳玲，张谨华

(晋中学院 生物科学与技术学院，山西 晋中 030619)

在我国，海带有着悠久的食用传统，在许多古代医学典籍中都有提及[1]，它是人们喜食的一种经济和营养价值兼具的多年生海藻食物，生长环境特殊，代谢物质独特，多分布于热带、温带的低温海域中。近年来，随着对海洋资源的不断开发，已有部分学者从海藻中分离得到多种可清除体内自由基、具有抗氧化作用的海藻活性物质[2]，如裙带菜多肽、海藻多酚等[3]。海带多酚是以间苯三酚为结构单元的聚合物，是一类重要的褐藻多酚化合物，褐藻多酚具有较好的抗氧化和抑菌作用，作为天然食品添加剂(抗氧化剂、防腐剂)应用于食品中。据文献报道，多酚的提取方法主要使用溶剂萃取法、闪式提取法、生物酶解提取法、树脂吸附提取法、超临界提取法、超声波辅助提取方法等[4-8]，这些方法中，超声波辅助提取方法由于操作简便、时间短、提取率高等特点而被广泛用于植物多酚的提取，即在一定温度下超声波机械震动，使细胞壁破碎，内容物流出，与提取剂充分接触发生反应[9]。提取工艺条件的优化对于原料的最大利用起着重要的作用。本试验采用响应面法优化海带中多酚的提取工艺，并通过测定海带多酚清除 DPPH 自由基及ABTS 能力，分析其抗氧化活性，旨在为海带的综合利用提供一定的依据。

1 材料及方法

1.1 材料、试剂与仪器

海带：采购于晋中市榆次区田森超市，购买回来后用水将海带洗净并用烘箱烘干至恒重，粉粹并用不同目数的筛子筛分，收集不同粒度的颗粒备用。无水乙醇(分析纯)：天津市凯通化学试剂有限公司；没食子酸、福林酚：北京索莱宝科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、ABTS：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

JP-040型超声波清洗机 广东广州市科洁盟实验仪器有限公司；EV-2600型紫外可见光分光光度 上海昂拉仪器有限公司；MJ-BL35F31搅拌机 美的生活电器制造有限公司；DZKW-4型恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 海带多酚的提取及多酚含量的测定[10]

称取1 g海带粉末于小烧杯中，加入乙醇进行超声处理，结束后取出烧杯，对超声后的液体进行抽滤处理，得清液。取1 mL清液，滴入3 mL福林酚并混匀，5 min后再滴入6 mL 7.5% NaCO3混匀，定容至25 mL，室温下，暗处放置2 h，于760 nm波长下测定吸光值。以没食子酸味为标准品得出标准曲线方程为：y=0.1815x+0.05(R2=0.9908)，进而可得多酚质量浓度，代入下式即可计算出多酚的提取率。

1.2.2 单因素试验1.2.2.1 物料粒度

称取不同粒度(10，30，50，70，90目)海带粉末1 g，加入25 mL 70%的乙醇，在50 ℃下超声30 min，考察物料粒度对多酚提取率的影响。

1.2.2.2 乙醇浓度

称取1.2.2.1确定粒度的海带粉末1 g，加入25 mL不同浓度(40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇，在50 ℃下超声30 min，考察不同乙醇浓度对多酚提取率的影响。

1.2.2.3 料液比

称取1.2.2.1确定粒度的海带粉末1 g，加入1.2.2.2确定浓度的不同体积分数(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)的乙醇，在50 ℃下超声30 min，考察料液比对多酚提取率的影响。

1.2.2.4 温度

称取1.2.2.1确定粒度的海带粉末1 g，加入1.2.2.2确定浓度的乙醇，按照1.2.2.3确定的料液比加入乙醇，在不同温度(30，40，50，60，70 ℃)下超声30 min，考察温度对多酚提取率的影响。

1.2.2.5 提取时间

称取1.2.2.1确定粒度的海带粉末1 g，加入确定浓度的乙醇，按照1.2.2.3确定的料液比加入乙醇，在1.2.2.4确定的温度下，考察不同超声时间(10，20，30，40，50 min)对多酚提取率的影响。

1.2.3 中心组合试验设计

通过对单因素试验的结果进行分析，选取超声温度、料液比、超声时间、乙醇浓度4个因子为自变量，以海带多酚提取率作响应值，采用Box-Behnken中心组合设计做四因素三水平的响应面分析，用Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析和作图。试验因素与水平表见表1。

表1 中心组合试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of central combination test design

1.2.4 海带多酚对DPPH自由基清除作用

参照文献[11,12]的方法。准确移取 0.2 mL 样品液于试管中，加入 2.8 mL 0.05 mg/mL DPPH，充分混匀，37 ℃水浴静置 30 min 后测定 517 nm下吸光度 A1(以无水乙醇为参比)；同时测定 DPPH 溶液与无水乙醇混合后的吸光度 A0，以及样液与无水乙醇混合后的吸光度 A2。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

1.2.5 海带多酚对ABTS清除作用

参照文献[13,14]的方法。将7 mmol/L的ABTS溶液5 mL与140 mmol/L的过硫酸钾 88 μL混合，制备ABTS+自由基储备液，避光反应 24 h，使用前用无水乙醇将储备液稀释至吸光度0.70±0.02(734 nm)，即得ABTS+·稀释液。取4.8 mL ABTS+·稀释液与 0.2 mL 稀释至适当浓度的样品溶液混匀，室温避光反应 15 min，以无水乙醇作参比在 734 nm 波长处测定吸光度 Ai；以等体积的无水乙醇代替样品溶液，同法操作，测定吸光度 A0；以等体积的无水乙醇溶液代替 ABTS+·溶液，同法操作，测定吸光度 Ai0。

ABTS+·清除率(%)=[1-(Ai-Ai0)/A0]×100。

1.2.6 数据处理

试验数据取3次重复的平均值。采用Design-Expert 8.0.6、SPSS 19.0 及Excel软件进行数据的方差分析及显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

按照单因素试验设计开展不同因素(物料粒度、乙醇浓度、料液比、超声温度、超声时间)对海带多酚提取率的影响研究，结果见图1(a～e)。

图1 各因素对海带多酚提取率的影响Fig.1 Effects of each factor on the extraction rate of kelp polyphenols

由图1中a可知，随着海带粉碎粒度的加大，多酚提取率呈不断上升趋势，在70目时达到最大值，然而超过70目后海带多酚的提取率逐渐减小。这说明物料粒度对多酚提取率会造成一定的影响，粒度越大，粉碎不彻底，不能将细胞破碎，内容物相对溶出的量较少而使提取率较低，粒度越小，颗粒越细，超声时细胞越容易破碎，与溶剂接触的相对表面积就越大，从而使多酚的提取率增高，但并不是粒度越细提取率越好，粒度过细会造成结块现象，同时还会给后续的抽滤带来一定的影响。因此，物料粒度70目为最佳值。

由图1中b可知，海带多酚提取率随乙醇浓度的增大而呈现先升高后降低的趋势，由于乙醇浓度的增加，导致溶液极性增强，符合相似相溶原理，之后可能由于其余化学物质的溶出，抑制了多酚类物质的溶解而使提取率减少[15]。因此，乙醇浓度70%为最佳值。

由图1中c可知，随着料液比的增大，海带多酚的提取率不断升高，当料液比大于1∶25以后，乙醇浓度的增加并没有使多酚的提取率持续上升而是趋于平稳状态，说明得到的多酚溶液已经趋于饱和状态，继续增加溶剂的体积可能会导致多糖等物质溶出[16]，并且给后期溶剂的处理与回收带来一定的负担。因此，料液比1∶25为最佳值。

由图1中d可知，随着超声温度的提高，在30～60 ℃之间，多酚提取率逐渐增大，在60 ℃海带多酚提取率达最大值，之后明显下降，可能是高温使得多酚类化合物的化学结构被破坏[17]，而使多酚提取率下降。因此，超声温度60 ℃为最佳值。

由图1中e可知，海带多酚提取率随着时间延长逐渐增大，在40 min时达最大值，提取时间变长，多酚可充分地溶出，使得提取率升高；当超过某一时间，多酚的提取率有所下降，可能与长时间超声作用使得海带中其他物质抑制多酚的溶出，使多酚提取率变低。因此，超声时间40 min为最佳值。

2.2 Box-Behnken试验结果

利用 Design-Expert 8.0.6 软件进行数据拟合，根据表 1设计的自变量因素超声温度(A)、料液比(B)、超声时间(C)、乙醇浓度(D)与海带多酚提取率的提取工艺参数回归模型组合，对表2 中数据进行二次回归拟合，建立提取工艺参数回归模型。回归方程为：Y=2.11+0.092A+0.14B+0.23C+0.14D+8.05×10-3AB-0.054AC-0.14AD-0.12BC+0.071BD-0.059CD-0.22A2-0.25B2-0.28C2-0.23D2，方差分析及显著性检验结果见表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experimental design and results

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression equations

注：当P<0.05时，表示差异显著，用“*”表示；当P<0.01时，表示差异极显著，用“**”表示。

由方差分析结果可知，回归模型P<0.0001，表明该模型极显著，失拟项P为0.6728>0.1，不显著，表明模型与试验拟合度较好，回归模型的决定系数为R2=0.9289，校正系数RAdj2=0.8578，说明该模型误差较小，可视为允许误差，能够对92.89%的响应值变化进行有效合理解释，模型的可信度高。因此，可用此方程模型确定超声辅助乙醇提取海带多酚工艺参数的分析和预测。

由方差显著性检测分析可知，B、C、D、A2、B2、C2、D2的P值均小于0.01，说明它们对海带多酚的提取率有显著影响，A及交互项AD、BC的P<0.05，说明它们之间差异显著。由F值大小可知，4个因素中对海带多酚提取率的影响为C>D>B>A。

通过Design-Expert 8.0.6软件做出各因素之间交互作用的响应面曲线图和等高线图，用来反映各组以海带多酚提取率为响应值的趋势图，见图 2(a～f)。响应面图中响应面坡度的陡峭程度及等高线的稀疏程度可直观反映出试验因素两两交互作用的显著程度，越陡峭说明响应值对操作条件的改变越敏感[18,19]，等高线呈椭圆形或马鞍形时则表示两因素交互作用显著，呈圆形时则表示两因素交互作用不显著。

图2 各因素交互作用对海带多酚提取率影响的响应曲面和等高线图Fig.2 Responsive surfaces and contours of the interaction of various factors on the extraction rate of kelp polyphenols

由图2中c可知，响应面图较陡峭，说明两因素交互作用显著，当温度固定时，随着乙醇浓度的增大，海带多酚的提取率呈逐渐升高的趋势，说明适当加大乙醇浓度有利于多酚物质的溶出；当乙醇浓度固定时，适当提高提取温度可加快海带多酚的溶出速度，等高线中乙醇浓度曲线变化密集程度高，说明乙醇浓度比温度对多酚提取率的影响大。由图2中d可知，提取时间曲面变化比较陡峭，同时等高线中的曲线变化密集程度高，因此，提取时间比料液比对多酚提取率的影响大。由图2中a可知，料液比较温度的曲线密集，说明料液比对多酚提取率的影响大。由图2中b可知，提取时间较温度多酚提取率的影响大。由图2中e可知，乙醇浓度较料液比对多酚提取率的影响大。由图2中f可知，提取时间较乙醇浓度对多酚提取率的影响大。

应用软件分析得出用乙醇作提取剂，超声辅助提取海藻多酚的最佳工艺条件为：超声温度64.18 ℃、料液比1∶27.5(g/mL)、超声时间43.9 min，乙醇浓度73.7%，此条件下海带多酚提取率预测值为2.139 mg/g。考虑实际操作的方便性，对这些参数稍作调整，确定超声温度65.0 ℃、料液比1∶28、超声时间45 min，乙醇浓度75%，对最佳工艺条件进行平行验证试验，测得海带多酚提取率为2.118 mg/g，与理论预测值接近，说明响应面优化结果可信。

2.3 海带多酚抗氧化活性

2.3.1 海带多酚对 DPPH 自由基清除作用

多酚物质是具有抗氧化、抗衰老等功效的一种重要的生物活性物质，其活性大小与多酚含量密切相关，DPPH自由基清除率是反映其活性的重要指标。以不同浓度的Vc溶液对DPPH自由基、ABTS的清除率为对照，研究不同浓度下海带多酚清除DPPH自由基及ABTS的变化规律，结果见图3。

图3 海带多酚及Vc对DPPH和ABTS自由基清除率的影响Fig.3 The effect of kelp polyphenols and Vc on the scavenging rates of DPPH and ABTS free radicals

海带多酚对DPPH自由基的清除率随浓度的增加而升高，至180 μg/mL时，达最大值68.87%，在0～180 μg/mL之间，多酚浓度对DPPH清除率拟合线性方程为y=8.7836x+12.57，相关系数R2=0.9822，通过拟合方程算出清除率的IC50=81.119 μg/mL。

2.3.2 海带多酚对ABTS清除作用

由图3 可知，随着海带多酚浓度的增大，对ABTS自由基清除率呈上升趋势，两者之间表现出较好的量效关系，在210 μg/mL时ABTS清除率最大，为49.73%，在0～210 μg/mL范围内，海带多酚浓度对ABTS清除率拟合线性方程为y=5.573x+7.7579，相关系数R2=0.9867，通过拟合方程算出清除率的IC50=222.224 μg/mL，可见海带多酚具有一定的ABTS清除能力。

3 结论

本试验以海带为研究试材，探究了影响超声提取海带多酚的因素，在单因素的基础上采用响应面法优化海带多酚提取工艺，并确定最佳工艺条件为：超声温度65.0 ℃、料液比1∶28(g/mL)、超声时间45 min，乙醇浓度75%，在此条件下海带多酚提取率为2.118 mg/g，接近模型预测值2.139 mg/g。通过测定海带多酚对 DPPH 自由基和ABTS的清除率可知，其清除能力与多酚浓度之间呈一定的正相关关系，清除率分别为68.87%和49.73%，相应的IC50为81.119 μg/mL和222.224 μg/mL，由此可知，海带多酚具有一定的体外抗氧化能力，陈浩南等的研究也发现，高良姜水提物中多酚含量较高，具有较好的ABTS和DPPH 自由基清除能力[20]。