基于培养鉴定法和高通量测序技术分析郫县豆瓣微生物群落结构演替

杨林子，卢云浩，何强

(四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065)

郫县豆瓣是以优质的辣椒和蚕豆为主要原料，经多种微生物发酵而成的半固态调味品，具有味辣香醇、红棕油亮、瓣粒酥脆、黏稠绒实、酱香浓郁的特点，堪称“川菜之魂”[1]。郫县豆瓣的生产包括辣椒发酵、制曲-蚕豆发酵和混合后熟发酵3个阶段，其酿制采用开放式的发酵体系[2]，利用发酵环境中的各类微生物进行物质代谢、转换和信息传递，从而形成郫县豆瓣独特的品质特征。但由于其微生物区系复杂，造成了目前发酵过程难于控制、产品品质不稳定等问题[3]。因此，为实现郫县豆瓣的定向控制发酵，提高生产效率，确保产品质量与安全，需对郫县豆瓣发酵过程中的微生物群落演替规律进行系统深入的认识。

近年来，高通量测序技术因产量大、错误率低、性价比高、灵活性好等优点，已广泛应用于发酵食品微生物多样性的研究，如意式Salami、韩式Doenjang、日式Miso等[4-6]，但该技术可以将样品中叶绿素及死菌DNA测定在内，导致微生物多样性结果往往高于样品实际情况。因此，多方法联用分析能更真实地反映食品中微生物的群落结构，本研究同时采用传统培养鉴定法和Illumina MiSeq测序技术分析郫县豆瓣3个发酵阶段的微生物群落演替情况，以揭示郫县豆瓣发酵过程中微生物的动态变化，为更好地认识传统发酵食品的发酵机制、优化发酵工艺、控制食品质量提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：取自郫县某豆瓣生产工厂，具体生产工艺见本团队研究成果[7]。本实验选取5个样品点：辣椒发酵末期、蚕豆发酵中期、蚕豆发酵末期、混合发酵中期、混合发酵末期(分别编号为1，2，3，4，5)。取样时从每个发酵池的上层(距表面0～20 cm)、中层(距表面30～50 cm)、下层(距池底0～20 cm)各取25.0 g左右，将其混合均匀，低温密封运送至实验室，于-80 ℃保存备用。

培养基：北京蓝桥生物技术有限公司；DNA提取试剂盒、Tris HCl、dNTP、引物：上海生工生物科技有限公司；E.Z.N.A.土壤DNA试剂盒：美国Omega公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒：美国Axygen公司；其他化学试剂：均为分析纯，成都科龙化工有限公司。

1.2 仪器与设备

P-330纳米光度计 Implen公司；Illumina MiSeq测序仪 Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 培养鉴定法

1.3.1.1 样品微生物计数、分离与纯化

将郫县豆瓣样品研磨均匀，准确称取25.0 g样品加至225 mL无菌生理盐水中充分混合后，进行梯度稀释(10-1～10-6)并涂布在YPD、NB及GAM培养基平板上，分别在28，37，37 ℃厌氧条件下培养后进行微生物计数，挑取形态各异的单一菌落进行分离纯化，采用相应液体培养基扩培后置于-80 ℃甘油中保藏备用，无菌水代替菌液作为空白组。

1.3.1.2 DNA提取与鉴定

微生物DNA依据细菌、真菌提取试剂盒说明书提取。

细菌PCR反应体系：25 μL 2×PCR Mix，1 μL DNA模板，引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)10 μmol/L各2 μL，20 μL ddH2O。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃保持10 min。

真菌PCR反应体系：25 μL 2×PCR Mix，1 μL DNA模板，引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′) 10 μmol/L各1 μL，22 μL ddH2O。反应条件同细菌。

PCR扩增产物利用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后，委托成都生工生物技术有限公司进行测序。

1.3.2 高通量测序技术

1.3.2.1 DNA的提取

依据E.Z.N.A.土壤DNA试剂盒提取样品中的DNA。

1.3.2.2 PCR扩增及MiSeq测序

PCR扩增，分别用338F(5′-GGACTACHVGGG-TWTCTAAT-3′)/806R(5′-GGACTACHVGGGTW-TCTAAT-3′)和ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAG-GAAGTAA-3′)/2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCG-ATGC-3′)通用引物对细菌16S rRNA和真菌ITS进行MiSeq测序，采用FastPfu DNA聚合酶进行PCR反应，每组样品设置3个平行，并利用2%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris HCl洗脱后进行荧光定量。根据TruSeqTM DNA试剂盒的说明书对PCR产物进行测序。

1.4 数据处理

通过Flash软件对1.3.2.2中所得序列进行拼接、过滤和优化，采用QIIME Pipeline去除低质量的数据，得到高质量序列进一步分析。以97%的相似性对操作分类单元(OTUs)进行分类，微生物α多样性利用香农指数(Shannon index)和Bayesian算法表示。

2 结果与分析

2.1 郫县豆瓣不同发酵阶段菌落总数

真菌、好氧细菌(含兼性厌氧细菌，下同)和厌氧细菌(含兼性厌氧细菌，下同)在郫县豆瓣各发酵阶段表现出了不同的变化，见表1。

表1 郫县豆瓣不同发酵阶段菌落总数Table 1 Total bacterial colony number of Pixian broad bean paste at different fermentation stages CFU/g

注：1为辣椒胚，2为蚕豆发酵中期，3为蚕豆发酵末期(甜瓣子)，4为混合发酵中期，5为混合发酵末期(郫县豆瓣)。

辣椒发酵阶段，生物量约为0.08×104～4.6×104CFU/g，均在较低水平，可能是由于发酵的高盐环境所致。蚕豆发酵阶段，由于米曲霉的接种，初期真菌总数达1.05×109CFU/g(数据未显示)，但随着发酵的进行，真菌总数不断下降，甜瓣子中真菌生物量降至1.1×104CFU/g；而好氧细菌的生物量大致维持在1.0×106CFU/g左右，高于厌氧细菌含量。混合发酵阶段，真菌总数不断增加，末期含量约为1.1×105CFU/g；好氧细菌一直维持在1.4×105CFU/g；厌氧细菌为该阶段的劣势菌，这可能是由于该阶段的定期翻缸，使得基质氧气均匀充足，不利于厌氧细菌的生长[8]。总体来看，在整个发酵过程中，蚕豆发酵阶段的菌落总数最高，好氧细菌和真菌为主要优势菌落。

2.2 培养鉴定法分析微生物群落结构

通过培养法共鉴定到12个属，27个种的微生物，见表2。

表2 基于传统培养鉴定法分析郫县豆瓣微生物多样性Table 2 Analysis of microbial diversity of Pixian broad bean paste based on traditional culture identification method

续 表

细菌的多样性及组成见图1。

图1 基于传统培养鉴定法分析郫县豆瓣不同发酵阶段的细菌群落结构Fig.1 Bacterial community structure of Pixian broad bean paste during different fermentation stages based on traditional culture identification method

注：1为辣椒胚，2为蚕豆发酵中期，3为蚕豆发酵末期(甜瓣子)，4为混合发酵中期，5为混合发酵末期(郫县豆瓣)。

由图1中A可知，好氧细菌中，整个发酵过程总体以Bacillussp.和Gracilibacillussp.为主要优势菌属。辣椒发酵阶段微生物多样性最为丰富，以Bacillusamyloliquefaciens和Gracilibacillustimonensis为主，两者占比达56.02%；蚕豆发酵阶段与混合发酵阶段菌落组成相似，均以Bacillusamyloliquefaciens，Bacillussubtilis，Bacillusmethylotrophicus为优势菌，但组成比例有一定差异，B.amyloliquefaciens含量在两个发酵阶段整体均呈上升趋势，最终占比分别为63.96%和72.93%；B.subtilis含量在蚕豆发酵后期有所减少，混合发酵阶段基本维持稳定，它是豆瓣中主要的腐败菌，但可以很好地抑制黄曲霉毒素的生长[9]。

由图1中B可知，厌氧细菌中，辣椒及蚕豆发酵阶段均以Tetragenococcushalophilus为优势菌，分别占比51.25%和71.19%，混合发酵阶段，Bacilluslicheniformis，Oceanobacillustimonensis两者占比达到95%以上，而T.halophilus几乎检测不到，这可能是由于T.halophilus有更好厌氧环境，而混合发酵阶段的定期搅拌使得发酵环境中氧含量充足。

对真菌而言，辣椒发酵阶段以Candidaetchellsii，Zygosaccharomycesrouxii为优势菌，两者占比分别为57.14%和32.65%，见图2。

图2 基于传统培养鉴定法分析郫县豆瓣不同发酵阶段的真菌群落结构Fig.2 Fungal community structure of Pixian broad bean paste during different fermentation stages based on traditional culture identification method

注：1为辣椒胚，2为蚕豆发酵中期，3为蚕豆发酵末期(甜瓣子)，4为混合发酵中期，5为混合发酵末期(郫县豆瓣)。

蚕豆发酵阶段，由于微氧及高盐环境，初期接种的Aspergillusoryzae随着发酵的进行占比不断减少，到末期仅占0.88%，这与蚕豆发酵阶段的真菌总数测定结果一致(见表1)；Candidaversatilis占比达到70%以上，Z.rouxii次之，约占20%。由于辣椒胚和甜瓣子的混合，混合发酵中期展现出最为丰富的真菌多样性，随着发酵的进行，部分微生物逐渐消亡，后期菌群由C.versatilis，Z.rouxii和C.etchellsii共同组成，三者占比分别为72.82%、13.59%、13.59%。

2.3 微生物多样性分析

微生物群落的多样性、丰富度及测序深度分别采用Shannon指数、Chao 1及Coverage来评估。

表3 基于97%相似水平的微生物群落多样性指数Table 3 Microbial community diversity indexes based on 97% similarity level

续 表

注：1为辣椒胚，2为蚕豆发酵中期，3为蚕豆发酵末期(甜瓣子)，4为混合发酵中期，5为混合发酵末期(郫县豆瓣)。

由表3可知，各样本的Coverage均大于99.9%，表明目前的测序深度较为合理，可以很好地反映样本中微生物的多样性变化情况。整体而言，蚕豆发酵阶段的细菌多样性最高，细菌丰富度最低；真菌多样性和丰富度在蚕豆发酵阶段均最低，这可能与米曲霉的接种有关。

2.4 Illumina MiSeq测序分析微生物群落结构

图3 Illumina MiSeq测序分析细菌群落组成变化Fig.3 Analysis of the change of bacterial community composition by Illumina MiSeq sequencing

注：1为辣椒胚，2为蚕豆发酵中期，3为蚕豆发酵末期(甜瓣子)，4为混合发酵中期，5为混合发酵末期(郫县豆瓣)。

从门水平来看，细菌群落共归属于5个门。由图3中A可知，相对丰度在1%以上的有Firmicutes，Cyanobacteria，Proteobaceria和Actinobacteria，这与Li等[10]的研究结果一致。辣椒发酵阶段以Cyanobacteria为主，其相对丰度约为76.2%；蚕豆发酵阶段，Firmicutes处于主导地位，Proteobaceria次之，两者相对丰度之和大于97%；混合发酵阶段，Firmicutes相对丰度随发酵进行不断增长，在末期其占比达94.4%。

从属水平来看，5个样本包括129个属的细菌。由图3中B可知，辣椒发酵阶段以norank-c-Cyanobacteria为主，其相对丰度约76.2%。蚕豆发酵阶段，细菌群落多样性丰富，随着发酵进行，Bacillussp.逐渐成为优势菌属，甜瓣子中其相对丰度约为35.6%；另外，Citrobactersp.，Lactobacillussp.，Enterobactersp.和Lactococcussp.也同样占据重要地位，相对丰度分别为12.03%、14.1%、7.82%、1.56%。混合发酵过程主要表现为Bacillussp.的显著增加，末期其相对丰度达93.6%，为主要的微生物群落。

图4 Illumina MiSeq测序分析真菌群落组成变化Fig.4 Analysis of the change of fungal community composition by Illumina MiSeq sequencing

注：1为辣椒胚，2为蚕豆发酵中期，3为蚕豆发酵末期(甜瓣子)，4为混合发酵中期，5为混合发酵末期(郫县豆瓣)。

郫县豆瓣的真菌群落归属于4个门，由图4中A可知，相对丰度在1%以上的有Ascomycota，Basidiomycota，unclassified_k_Fungi。辣椒发酵阶段以Ascomycota和Basidiomycota占优势地位，两者相对丰度约为99.8%。蚕豆发酵阶段及混合发酵阶段Ascomycota相对丰度达到95%以上，在真菌群落结构中占据主导地位。

从属水平来看，样品中真菌群落共鉴定到70个属的微生物，其中相对丰度在1%以上的见图4中B。辣椒发酵阶段以Aspergillussp.，Alternariasp.，Wallemiasp.，Cryptococcussp.和Candidasp.为优势菌群，占比分别为38.15%、18.83%、15.37%、13.0%、5.78%；蚕豆发酵阶段，Aspergillussp.的相对丰度始终维持在99.0%以上；混合发酵阶段菌落多样性较为丰富，但仍以Aspergillussp.为优势菌属，到末期相对丰度增至84.8%。

前人曾对郫县豆瓣中的微生物进行了大量的相关研究和报道，如张琦等[11]运用PCR-DGGE技术研究了郫县豆瓣自然发酵过程中细菌群落结构的变化，揭示了细菌群落变化较为明显，且Staphylococcusxylosus和乳酸菌为优势细菌；汪先丁等[12]利用PCR-DGGE指纹图谱技术研究郫县豆瓣自然发酵过程中真菌群落的演替，结果显示Aspergillusoryzae是发酵前期的优势真菌。本研究采用的两种方法均有鉴定到Bacillussp.，Gracillibacillussp.，Staphylococcussp.，Aspergillussp.，Candidasp.和Zygosaccharomycessp.，有效地证实了在郫县豆瓣发酵过程中这些微生物的存在。然而，两种方法鉴定结果也存在一定的差异，一些微生物如norank-c-Cyanobacteriasp.，Citrobactersp.，Alternariasp.，Wallemiasp.和Cryptococcussp.仅被Illumina MiSeq测序鉴定为优势菌属，一方面是因为现阶段许多微生物还不能被选择性培养基培养[13]；另一方面，辣椒叶绿素DNA序列与norank-c-Cyanobacteria序列相似，可能导致高通量测序结果错误[14]。此外，Illumina MiSeq测序结果表明Aspergillussp.在蚕豆发酵和混合发酵阶段均占据绝对优势地位，但培养鉴定法表明其在发酵过程中快速死亡，在成品中并未被鉴定到。Lactobacillussp.，Weissellasp.，Penicilliumsp.也有类似情况，它们仅在蚕豆发酵初期被鉴定到(数据未显示)，这可能是由于Illumina MiSeq测序可以检测到死亡微生物群落但DNA未降解的核苷酸序列[15]。因此，结合传统培养法和高通量测序分析可以为了解郫县豆瓣3个发酵阶段的微生物群落演替提供补充支持。

3 结论

通过培养鉴定法和Illumina MiSeq测序技术结合分析郫县豆瓣的微生物群落结构，实验结果显示：在整个发酵过程中，细菌的群落组成变化较大，其中蚕豆发酵阶段的微生物菌落总数最高，混合发酵展现了丰富的微生物多样性。辣椒发酵阶段，真菌以Aspergillussp.，Alternariasp.，Wallemiasp.，Cryptococcussp.，Candidasp.为优势菌属，细菌以Gracilibacillussp.，Bacillussp.为优势菌属。蚕豆发酵细菌主要包括Bacillussp.，真菌以Candidasp.，Zygosaccharomycessp.的丰度较高。混合发酵阶段，好氧细菌和真菌占比均衡，分别以Bacillussp.,Candidasp.，Zygosaccharomycessp.为优势菌属。结合两种分析方法全面、真实、有效地反映了郫县豆瓣发酵过程中微生物的多样性及菌群组成，揭示了微生物群落结构演替过程，可为后续优化郫县豆瓣的发酵工艺提供理论指导。