四川兔病毒性出血症2型的分子生物学诊断

陈斌 ，周明忠*，王泽洲，丁梦蝶，张毅，李丽，陈冬，岳建国

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省成都市动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041）

兔病毒性出血症2 型（RHD2），又称兔瘟2型，是由兔出血症病毒2型（RHDV2）引起的危害家兔和野兔的一种高度传染性、急性致死性疫病。RHDV2 是一种新型的兔出血症病毒（RHDV）毒株，主要危害15 日龄以上的家兔和野兔，引起的临床症状与经典兔病毒性出血症（RHD）相似，但毒株特性差异较大，经典RHDV 疫苗几乎不能预防家兔感染。RHD2于2010年4月在法国首次报道［1］，随后在葡萄牙、意大利、西班牙等欧洲国家传播，并进一步传播到美洲和大洋洲［2］。RHD2 是世界动物卫生组织（OIE）法定通报疫病，在我国属于二类动物疫病，病兔的死亡率为5%～70%。

1 发病情况

2020 年4 月，四川省成都市金堂县两个兔场出现家兔异常死亡。兔场A 发病前存栏家兔2 500余只，死亡1 000余只，发病后紧急接种兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌二联蜂胶灭活疫苗。兔场B 发病前存栏家兔1 000余只，死亡500多只，发病后紧急接种兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗（VP60 株）。在接种疫苗后两兔场的发病及死亡情况均未好转。

2 临床症状和剖检病变

两兔场病死兔的临床症状和剖检病变均相似。临床症状主要表现为厌食、反应迟钝、嗜睡、拉稀（粪便颜色呈黄色），有的出现症状后1～2 h即死亡；剖检可见全身实质器官出血、淤血、肿大，肝脏、脾脏边缘梗死等。

3 实验室诊断

综合发病情况、临床症状、剖检病变以及兔病毒性出血症疫苗免疫无效，怀疑两兔场为RHDV2感染。从两兔场分别采集2 只病死家兔的肝脏、脾脏等脏器进行实验室检测。

3.1 病毒RNA 提取 用无菌剪刀分别剪取每只病死兔的肝和脾等脏器，混合，加入1 mL 灭菌PBS（pH7.2）和研磨介质，在组织破碎仪中进行匀浆，取出后8 000 r/min 离心2 min，取上清用于RNA 提取。使用核酸提取试剂盒（磁珠法）和核酸自动提取仪进行核酸提取。

3.2 RT-PCR 扩增 参考2018 版OIE《陆生动物卫生法典》，使用OIE 推荐的RHDV2 特异性引物进行VP60 基因片段扩增，上游引物序列为5′-GAATGTGCTTGAGTTYTGGTA-3′，下游引物序列为5′-CAAGTCCCAGTCCRATRAA-3′，扩增产物长度约794 bp［3］。RT-PCR扩增反应体系：10 μL 2×1 step buffer、0.8 μL Enzyme mix、上下游引物各0.5 μL（20 μmol）、2 μL RNA、6.2 μL RNase Free H2O，反应总体积为20 μL。RT-PCR反应采用一步法，反应条件：50 ℃30 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃50 s，35 个循环；72 ℃5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

3.3 序列分析 RT-PCR 扩增产物经凝胶电泳确认有目的条带后送上海生工进行测序。将测序结果输入Blast中进行序列比对，并从GenBank数据库中下载部分RHDV2 和经典RHDV 毒株序列，采用Larsergene 软件MegAlign 进行核苷酸同源性分析，用MEGA6 软件Neighbor-Joining 法进行遗传变异分析。

4 结果

4.1 RT-PCR 扩增 电泳结果（图1）显示，从两兔场病死兔的组织混合样品中均扩增出约800 bp的特异性条带，与预期大小（794 bp）一致。

图1 兔出血症病毒2型（RHDV2）的RT-PCR电泳结果

4.2 序列分析 经测序和Blast 比对，结果显示来自两个发病兔场的2 条序列均与RHDV2 参考毒株的VP60 部分序列高度同源，其中同源性最高的是荷兰RHDV2 分离株RHDV2-NL2016（GenBank登录号MN061492.1），分别为98.01%和97.95%。MegAlign 分析结果（图2）显示2 条序列的核苷酸同源性为99.1%，与RHDV2 毒株VP60基因片段的核苷酸序列同源性为94.1%～98.3%，与经典RHDV 毒株VP60 基因片段的核苷酸序列同源性为79.0%～80.0%。遗传进化分析结果（图3）也显示2条序列与RHDV2毒株在同一分支上，亲缘关系较近，而与经典RHDV 毒株的亲缘关系则较远。综合上述结果，确定两发病兔场的病死兔均为RHDV2感染，并将兔场A和兔场B家兔组织病料中的RHDV2 毒株分别命名为SCADCJT01和SCADC-JT02。

5 讨论

兔瘟2 型与经典兔瘟的临床症状相似，从发病情况和症状上难以区分，需要进行实验室鉴别诊断。对于兔瘟病毒2 型的检测，目前国内尚无相关的商品化试剂盒。本次检测使用的是OIE《陆生动物卫生法典》推荐的RHDV2 特异性引物，该对引物能够从病死兔组织样品中扩增出特异性条带，说明其适用于本次RHD2 疫情的分子流行病学调查。

兔瘟2 型主要在欧洲国家流行，此次是我国首次官方确诊RHD2 疫情［4］。四川为内陆省份，两发病兔场又位于远离市中心的乡镇，人员流动较少，且两场均有引种史，分析此次RHDV2感染可能与引种有关。此外，两发病兔场位于同一乡镇，来自两场的2 条VP60 部分序列的同源性高达99.1%，表明两发病兔场可能有相同的病原源头。

图2 VP60基因部分核苷酸序列的同源性分析结果

图3 VP60基因部分核苷酸序列的遗传进化树

兔瘟2 型曾在澳大利亚迅速传播和流行，表现出比经典兔瘟更强的传播力与致病性，并且逐渐取代了经典兔瘟［5］。养兔业是四川省畜牧业的重要组成部分，经典兔瘟疫苗不能对兔瘟2 型进行有效保护，兔瘟2型一旦流行，将会对全省养兔业造成巨大的经济损失，因此对该病必须给予高度重视。为防止病原扩散，对两兔场所有剩余存栏兔立即进行了扑杀和集中无害化处理，对饲养相关用具、饲料、垫料、粪污等严格限制移动，并进行彻底的清理、消毒、清洗和再消毒。同时，对两兔场的饲养区、生活区及周围环境进行了彻底消毒，并限制两兔场周边3 km 范围内所有家兔的移动和交易。此外，应加强全省兔瘟2 型的流行病学调查，积极开展排查和监测工作，并加快相关疫苗研制，切实为兔瘟2 型的防控提供保障。