西马特罗多克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立

司艳芳，李 鹏，郭东光，孙国鹏，岳 锋，王选年

(1.新乡学院 生命科学技术学院，河南 新乡 453003；2.郑州大学 生命科学技术学院，河南 郑州 450000)

西马特罗(Cimaterol,CIM)也称喜马特洛、塞曼特罗，为白色晶体结构，极性中等。西马特罗能影响生猪体内的物质代谢，促进腺苷酸环化酶的合成，减少脂肪的合成并促进其分解，增加肌肉中蛋白质含量[1]。其与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等10余种物质类似，属于β2型肾上腺类受体激动剂，俗称为瘦肉精，在20世纪80年代，由美国科研人员发现[2]。近年来，许多不法饲养业受到利益驱动，在动物的饲粮或饮水中添加西马特罗，长期使用会造成西马特罗在动物组织内蓄积残留。人在摄食了瘦肉精高残留的动物组织，轻者会出现头疼目眩、恶心呕吐等不适症状，重者会引起食用者中毒，严重的甚至有生命危险[3]。自从世界上首次发生瘦肉精中毒事件，已累计有近万人中毒。食品安全控制中心为了达到控制西马特罗的目的，筛查工作通常分2个阶段进行：先进行免疫化学筛选，然后进行气相色谱-质谱(GC-MS)或液相色谱-质谱(LC-MS)进一步确认。这样可以精准鉴定样本中是否含有西马特罗等非法添加物，但上述仪器昂贵且操作复杂，对于大部分企业难以实现日常的监测[4]。

β2型受体激动剂在动物生产中的广泛应用带来了一系列食品安全问题。随着食品安全法规越来越严格，开发快速、灵敏的方法来检测肉类、加工食品和乳制品中非法添加物的残留具有至关重要的意义[5]。目前，竞争ELISA测定法用于定量检测非法添加物，具有简单、快速、对大样本敏感、特异性好且成本低等优点，引起了极大关注。为此，应用西马特罗免疫抗原免疫兔子，制备多克隆抗体，旨在建立其快速检测方法，为β2型受体激动剂残留药物检测方法的建立提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

西马特罗及其他小分子标准品、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂均购自Sigma-Aldrich公司;TMB单组分显色液及HRP标记羊抗兔IgG购自Solarbio公司；TEMED、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵等购自华美生物公司。

1.2 主要仪器

磁力搅拌器、紫外全波长扫描仪、分光光度计、酶标仪、恒温培养箱、培养摇床、蛋白电泳仪。

1.3 主要溶液体系

透析液：0.01 mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；包被液：0.05 mol/L、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)；洗脱液(PBST)：含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L、pH值为7.4)；封闭液：含5%脱脂奶粉的PBST；终止液：2 mol/L H2SO4溶液。0.1 mol/L浓盐酸溶液：50 mL蒸馏水中含450 μL浓盐酸溶液，pH值为2；0.15 mol/L NaNO2溶液：0.517 g NaNO2溶于50 mL蒸馏水；5%尿素：2.5 g尿素溶于50 mL蒸馏水；0.1 mol/L 硼酸缓冲液(含0.15 mol/L NaCl)：3.09 g H3BO3，4.383 g NaCl,溶于500 mL水中，pH值为8.6。

1.4 免疫抗原的制备

(1)将4 mg西马特罗标准品溶于0.1 mol/L浓盐酸溶液(pH值为2)中混匀，浓盐酸溶液需要提前放置冰上预冷30 min。(2)向上述溶液匀速逐滴加入预冷的0.15 mol/L的NaNO2溶液，在冰上避光操作，同时使用淀粉碘化钾试纸监控，直至试纸变成蓝紫色时停止加入。(3)避光低温低速搅拌4～4.5 h。(4)用NaOH将溶液调至pH值为7.4，5%尿素水溶液中和过量的NaNO2，每次滴加均用淀粉淀化钾试纸检测，试纸由深蓝变为浅蓝，即停止，反应液低温保存备用。(5)称取17 mg BSA粉末溶于1 mL 0.1 mol/L硼酸缓冲液(pH值为8.6)，将第4步所得混合液逐滴加入到BSA蛋白溶液中，放于4 ℃避光低速搅拌24 h。(6)将反应得到的亮黄色偶联产物收集在透析袋中(透析袋使用前在沸水中煮沸10 min)，在PBS中低温透析3 d，每间隔8 h换一次透析液[6-8]。

1.5 检测抗原的制备

图1 西马特罗的分子结构Fig.1 Molecular structure of cimaterol

图2 西马特罗完全抗原的制备流程Fig.2 Preparation process of cimaterol complete antigen

1.6 抗原的表征与鉴定

1.6.1 SDS-PAGE鉴定完全抗原 SDS-PAGE凝胶电泳分离胶和浓缩胶的含量与目的蛋白的分子质量有关[9]。本试验选用的载体蛋白BSA、OVA的相对分子质量分别为66.4 ku、42.3 ku。目的蛋白分子质量在30～100 ku，应使用的浓缩胶含量为5%，分离胶含量为10%，凝胶配制参照《分子生物学实验》。浓缩胶电压选择120 V，分离胶电压选择80 V，凝胶厚度1.5 mm，上样量为2 μg，考马斯亮蓝染色3～4 h后，置脱色液中过夜脱色。偶联小分子的载体蛋白的完全抗原大于单纯的载体蛋白分子质量，迁移速率小。由此可以判断出载体蛋白上是否偶联有小分子，另外根据分子质量还可以初步计算完全抗原的偶联比。

1.6.2 紫外全波长扫描法鉴定完全抗原 一般蛋白质的最大吸收峰在280 nm波长处，载体蛋白偶联小分子后，其最大吸收峰会发生偏移，或产生新的吸收峰。用紫外吸收法测定其蛋白质的浓度和特征峰，在波长200～500 nm范围内进行紫外扫描，根据吸收峰的变化判断是否偶联成功[10]。

1.6.3 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和高分辨质谱(ESI-MS)法鉴定完全抗原 MALDI-TOF-MS和ESI-MS系统能精准地对完全抗原进行分子质量测量，采用 MALDI-TOF-MS 和 ESI-MS 质谱同时进行的策略，目的在于有效消除试验及测量过程中的误差，可以更加精确地计算西马特罗与载体蛋白的偶联比[11-12]。

1.7 多克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

1.7.1 动物免疫 取3月龄健康洁净级新西兰大白兔3只(购自郑州大学实验动物中心)，首免用免疫原CIM-BSA与弗氏完全佐剂充分乳化，免疫剂量为500 μg/只，背部皮下多点注射；2免、3免均用弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔14 d[13]。3免后第10天耳缘静脉采血，测定血清效价，选择血清效价高且对西马特罗抑制作用强的兔子，分离其血清进行后续试验。

1.7.2 多克隆抗体效价测定 多克隆抗体用间接ELISA法检测效价。包被：以CIM-OVA偶联物为包被原，用包被液稀释至2 μg/mL，分别加入96孔ELISA反应板，每孔加入50 μL，4 ℃ 包被过夜。封闭：弃去包被液，以 PBST 连续洗板5次，最后一次间隔 5 min，于干净的吸水纸上轻拍至没有明显水珠，每孔加入 200 μL 5% 脱脂奶粉-PBST 作为封闭液，37 ℃条件下封闭1 h。孵育一抗：用洗涤液PBST洗板5次，拍干，以经封闭液稀释后的兔源多抗血清为一抗(稀释范围1∶1 000～1∶128 000)，每孔加入50 μL，37 ℃条件下孵育30 min，同时设置未免疫的血清为阴性对照。孵育二抗：用PBST洗板5次，拍干，以HRP标记羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)作为二抗，每孔加入 50 μL，37 ℃条件下反应30 min。终止及显色：用洗涤液PBST连续洗板5次，拍干后每孔加入 50 μL TMB显色液，室温避光条件下反应10 min，加入25 μL 2 mol/L的H2SO4终止液终止显色。读数：用全波长的酶标仪在450 nm处测定吸光值[14-15]。

1.8 间接竞争ELISA检测方法的评估

1.8.1 灵敏度测定 将上述ELISA 操作中的一抗换成最佳稀释度的抗体，加入不同质量浓度的西马特罗标准品溶液，其他操作相同。以添加标准品对包被抗原 50% 抑制浓度作为半数抑制浓度(IC50)。西马特罗小分子竞争品的最适质量浓度的确定方法为：先选取10、100、1 000、5 000 μg/L作为添加西马特罗的质量浓度，初步确定西马特罗标准品对血清的半数抑制浓度，然后缩小范围建立标准曲线并精确计算半数抑制浓度[16-17]。

1.8.2 特异性测定 将1.8.1方法中的西马特罗标准品溶液换成不同质量浓度的其他类型β2型受体激动剂标准品溶液。然后通过间接竞争ELISA 绘制出多克隆抗体对各小分子标准品的标准抑制曲线，求出各药物的半数抑制浓度，判断制备的多克隆抗体的特异性[18]。计算交叉反应率：交叉反应率(CR)= IC50(CIM)/IC50(竞争物)×100%。

不知是为了打击她的嚣张气焰，还是出于什么暧昧的动机，我把我找工作的详情对叶霭玲说了。我告诉叶霭玲说，这份工作完全是仰仗白丽筠的结果，她在中间帮了很大的忙。如我预料的一样，立即遭到了她的嘲笑。叶霭玲一定是满怀嫉妒，报之以冷笑，说，她帮你找到了工作，你拿什么报答她呀？

1.8.3 最低检测限测定 根据统计学方法，使用最佳条件，按照间接竞争ELISA检测方法对抑制品进行检测，记录其OD值，抑制率99%时对应的小分子药物质量浓度为最低检测限，反映该检测方法的灵敏度[19]。

1.8.4 亲和力测定 抗体与特异性抗原的亲和力越高，则灵敏度越高，即检出限越低。亲和力常数为最低检出量(灵敏度)的倒数，通常用K表示，单位是升/摩尔(L/mol)[20]。

1.8.5 回收率测定 分别用猪尿液和饲料进行样品的添加回收试验。所用的猪尿和饲料均取自新乡县养殖场，饲料按照国家标准《 饲料中16种β2型受体激动剂液相色谱-串联质谱法的测定》的规定，采用甲醇提取处理，并用稀释的方法消除样品基质效应，猪尿进行离心去除杂质[21]。参照间接竞争ELISA方法，向预处理之后的阴性饲料样品和猪尿样品中分别添加0.5、1.0、10.0 μg/L的小分子标准品，同时设置阴性对照孔。按照上述间接竞争ELISA最佳条件操作，重复试验3次，计算OD450平均值和样品的含量。

2 结果与分析

2.1 完全抗原的鉴定

2.1.1 SDS-PAGE鉴定 载体蛋白偶联半抗原后会导致在SDS-PAGE电泳中泳动速度变慢。SDS-PAGE 鉴定结果表明，BSA和OVA的泳动速度均大于CIM-BSA 和 CIM-OVA(图3)，证明西马特罗与BSA和OVA偶联成功。

图3 CIM-BSA、CIM-OVA的SDS-PAGE鉴定Fig.3 SDS-PAGE indentification of CIM-BSA,CIM-OVA

2.1.2 UV鉴定 通常载体蛋白上偶联小分子后，其最大吸收峰会发生偏移，或产生新的吸收峰。如图4所示，分别扫描了缓冲溶液PBS、载体蛋白和载体蛋白-半抗原，用缓冲溶液校准去除基质的干扰，比较载体蛋白和偶联物的最大吸收峰波长的区别，明显出现了非同于载体蛋白在280 nm处的新吸收峰，可以基本判断人工完全抗原偶联成功。

2.1.3 质谱鉴定 单个西马特罗的分子质量为219.28 u，载体蛋白BSA分子质量为66.4 ku。通过质谱分子质量测定计算偶联比，测试品CIM-BSA的分子质量为68 156.9 u，相比单独载体蛋白BSA的分子质量增加了1 756.9 u，说明CIM-BSA完全抗原偶联成功，经计算偶联比约为8∶1(图5A)；同理，测试品CIM-OVA的分子质量为44 382.5 u，与单独的载体蛋白OVA的相对分子质量相比，增加的分子质量为2 082.5 u，约为单个西马特罗的分子质量的10倍，说明CIM-OVA完全抗原偶联成功，偶联比约为10∶1(图5B)。

图4 CIM-BSA、CIM-OVA紫外扫描鉴定Fig.4 UV scanning identification of CIM-BSA,CIM-OVA

图5 CIM-BSA、CIM-OVA质谱鉴定Fig.5 The mass spectrometry identification of CIM-BSA,CIM-OVA

2.2 多克隆抗体的效价测定

将第3次免疫10～14 d后的兔血清倍比稀释后，间接ELISA检测血清的效价(表1)。当450 nm波长处的吸光值是阴性孔的2.1倍时，记为阳性孔。阳性孔的最大稀释度是多克隆抗体的效价。经计算，制备的完全抗原免疫效果良好，抗体效价达到1∶64 000。

表1 免疫血清间接ELISA效价测定Tab.1 The immunity serum titer measured by indirect ELISA

2.3 间接竞争ELISA检测方法的评估

2.3.1 灵敏度测定及标准曲线的建立 由添加西马特罗标准品的间接竞争ELISA试验结果可知，抗西马特罗血清的半数抑制浓度在1～5 μg/L。故选择小分子抑制品标准溶液质量浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 μg/L，对结果进行处理并建立标准曲线。如表2，无抑制品的对照孔OD450值为1.222，其IC50约为4.26 μg/L。根据此检测方法建立标准曲线,y=-0.246 9x+0.662 3(图6)。曲线的拟合度为0.977 1，说明测量中数值误差较小，曲线的拟合效果良好。

表2 CIM标准品间接竞争ELISA检测结果Tab.2 The results of CIM standard solution measured by indirect competitive ELISA

图6 间接竞争ELISA标准曲线的建立Fig.6 Standard curve established by indirect competition ELISA

2.3.2 特异性测定 用于抗体交叉反应性研究的竞争物为其他β2型激动剂药物如盐酸克伦特罗(CL)、莱克多巴胺(RAC)、沙丁胺醇(SAL)、盐酸多巴胺(DH)、溴布特罗(BRO)、班布特罗(BAM)、齐帕特罗(ZIL)、特布他林(TBL)、达氟沙星(DAN)、泰乐菌素(TYL)。由表3可知，免疫血清与其他小分子药物的交叉反应率均小于0.01%，说明获得的多克隆抗体的特异性良好，可以用于西马特罗残留检测。

表3 免疫血清与其他药物的交叉反应率Tab.3 Cross-reactivity rate between immunity serum and other drugs

2.3.3 最低检测限 根据标准曲线可知，该间接竞争ELISA检测方法对西马特罗的最低检出限为0.04 μg/L。

2.3.4 亲和力常数 在本试验中影响亲和力常数最重要最关键的是完全抗原的质量。根据最低检测限计算，亲和力常数可达10-13L/mol。

2.3.5 回收率 由表4可知，猪尿中西马特罗的回收率介于96.3%～103.9%，饲料中的回收率介于67.0%～105.0%。

表4 添加样品回收试验结果Tab.4 The recovery results of addimg samples

3 结论与讨论

与其他方法相比，间接竞争ELISA检测方法具有灵敏度高、快速、简便的优势，为残留检测提供了重要手段。获得良好的抗体是建立该方法的必要条件，西马特罗由于自身分子质量较小，不具有免疫原性，必须将其连接到一些大分子蛋白质载体上成为完全抗原。完全抗原进入动物体内借助载体蛋白的T细胞表位间接诱导B细胞激活、分化、增殖，使其同时具备T细胞表位和B细胞表位，进而刺激B淋巴细胞分化为浆细胞，产生针对半抗原小分子的特异性抗体。有研究证实，含有苯胺基的半抗原，在制备其完全抗原时，采用重氮化法获得的偶联效果最佳。职爱民等[22]利用重氮化法制备了西马特罗完全抗原，免疫小鼠获得多克隆抗体，该抗体对西马特罗的IC50为86.9 μg/L，这是国内首例有关西马特罗完全抗原的合成及免疫学分析方法的报道。相比之下，本研究利用多克隆抗体血清建立的检测西马特罗的间接竞争ELISA方法的IC50为4.26 μg/L，在灵敏度方面，该方法具有明显优势。HAUGHEY等[23]研制出能同时检测多种β2型激动剂的胶体金免疫层析试纸条，其对克伦特罗的灵敏度最高，检测线性范围为0.31～4.52 μg/L，IC50为1.18 μg/L，最低检测限为0.14 μg/L,但与沙丁胺醇、马布特罗、溴布特罗、氯丙那林、西马特罗等药物均有交叉。阴性猪尿的样品添加回收试验中，其回收率在83.6%～102.2%。本研究建立的检测西马特罗的间接竞争ELISA方法，针对西马特罗残留进行特异性测定，与其他药物无交叉反应，检测范围为0.1～12.8 μg/L，在此范围内线性拟合关系良好。该方法的最低检测限为0.04 μg/L，猪尿中西马特罗的回收率介于96.3%～103.9%，饲料中的回收率介于67.0%～105.0%。本研究在饲料样品中进行添加回收试验，增加了对该检测方法的实用性评价，且该检测方法不仅可以对西马特罗进行定量检测，还可对其进行定性检测。近年来，为了提高西马特罗检测精确度，ZHANG等[24]用磷光二氧化硅纳米颗粒标记西马特罗免疫层析试纸条，结果表明，其最低可检测到匹克级的痕量残留，具有简便、直观等优点。相比于本研究建立的间接竞争ELISA方法，试纸条的检测速度快，但假阳性率较高。

综上，本研究利用获得的抗西马特罗多克隆抗体，建立了间接竞争ELISA方法，具有良好的特异性、灵敏性、准确性。