基于SCoT标记的猕猴桃种质资源遗传多样性研究

2020-06-19 08:31:52周遇巧郭国业李书林
河南农业科学 2020年6期
关键词:软枣猕猴桃美味

周遇巧,郭国业,周 索,杜 戈,李书林

(1.南阳师范学院 生命科学与技术学院,河南 南阳 473061;2.河南省西峡猕猴桃研究所,河南 西峡 474573)

猕猴桃原产中国,是属于猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(ActinidiaLindl.)的多年生藤本植物[1]。全世界现有约66种猕猴桃属植物、118个分类单位(变种、变型)[1],最新的分类系统研究将其划分为54种、21个变种,共75个分类群[2-3]。研究表明,猕猴桃多数产于中国,中国被认为是猕猴桃属植物的起源、进化和分布中心,猕猴桃集中分布于秦岭以南、横断山以东的地域[3-4]。丰富的猕猴桃野生种质资源为猕猴桃属植物的系统进化研究、品种选育和产业发展提供了条件。

由于猕猴桃为雌雄异株植物,染色体倍性呈现多倍化,种间和品种间的杂交严重,导致遗传背景错综复杂,谱系亲缘关系模糊不清,严重影响到猕猴桃种质鉴定、品种改良和新品种的培育与开发利用。中华猕猴桃(Actinidiachinensis)和美味猕猴桃(A.chinensisvar.deliciosa)存在较为广泛的野外居群的重叠分布[5],使得杂交后代存在丰富的基因型和表型。因此,加强对猕猴桃种质资源遗传多样性与进化的研究对猕猴桃种质资源保护和利用以及新品种培育具有重要意义。起始密码子多态性(Start condon targeted polymorphism,SCoT)是COLLARD等[6]根据植物基因组ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性而开发的一种目的基因分子标记,其操作简单方便,引物遗传信息丰富,多态性好。目前,SCoT分子标记已被成功应用于菊花、地黄、桂花、梨等多种植物的遗传多样性研究,特别是在遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱建立等方面取得较多进展[7-10]。在猕猴桃种质资源多样性研究方面,简单重复序列间扩增多态性(ISSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性(RAPD)等分子标记已经成功应用于猕猴桃种质资源的遗传多样性研究[11-13],而应用SCoT分子标记的研究尚较少。陈伯伦等[14]利用SCoT分子标记对17个猕猴桃品种(系)进行遗传多样性和变异鉴定,发现3个变异株系均与对照品种(红阳和金桃)有一定的亲缘关系,可以有效区分猕猴桃性状变异。本研究运用SCoT分子标记技术,对28份猕猴桃种质资源的遗传多样性和亲缘关系进行分析,为猕猴桃种质关系鉴定、优良基因型挖掘和保护、新品种选育提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为美味猕猴桃、中华猕猴桃以及近缘种,共28份,分别来源于河南、陕西、贵州等地。其中,美味猕猴桃种质包含米坪行上1号、寨根3号、实生2号等。中华猕猴桃种质包含通山5号、华光2号、华光3号等。近缘种为大籽猕猴桃(A.macrosperma)、软枣猕猴桃(A.arguta,雌、雄)。利用无菌水和75%乙醇,将采集的猕猴桃植株新鲜幼嫩叶片冲洗干净,分别放置于装有硅胶的采集袋中,保存于-20 ℃的冰箱。供试猕猴桃材料信息见表1。

表1 28份供试猕猴桃种质的名称及来源Tab.1 Name and origin of 28 tested Actinidia germplasms used in the experiment

1.2 基因组DNA提取

利用植物基因组DNA提取试剂盒,采用改良CTAB法提取猕猴桃基因组DNA,并用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。提取的样品基因组DNA用核酸微量测定仪稀释至一致浓度(50 ng/μL),于-20 ℃下保存备用。

1.3 SCoT-PCR反应体系建立

参考袁王俊等[7]、和世玉等[9]和杨珂等[10]的SCoT-PCR方法并进行探索,建立猕猴桃SCoT-PCR反应体系与扩增程序。SCoT-PCR的反应体系:总体积20 μL,其中2×TaqPlus Master Mix 10.0 μL、SCoT引物1.0 μL、模板DNA 1.0 μL、ddH2O 8.0 μL。反应程序:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性50 s,退火50 s,72 ℃延伸60 s,共35个循环;72 ℃延伸10 min。

1.4 引物筛选与SCoT-PCR扩增

供筛选所用的55条SCoT分子标记引物由武汉擎科生物技术有限公司合成。随机选取5个猕猴桃种质的模板DNA,进行SCoT-PCR扩增。通过对PCR扩增产物进行凝胶电泳多态性指纹图谱检测,最终筛选出多态性高、重复性好、位点清晰的8条引物用于所有供试材料的遗传分析。筛选出的引物信息如表2所示。采用筛选出的8条SCoT标记引物对28份猕猴桃材料基于优化反应体系和扩增程序进行PCR扩增,利用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,在核酸凝胶成像系统下观察、拍照、保存。

表2 筛选出的8条SCoT引物序列及其退火温度Tab.2 The sequences of 8 screened SCoT primers and annealing temperatures

1.5 数据分析

根据核酸多态性扩增图谱,以“0/1”统计SCoT扩增带型,在相同迁移率位置上,有带记为“1”,无带记为“0”,建立引物扩增的“0/1”分子数据矩阵,并依据分析软件进行数据格式转换。采用POPGEN 32软件计算SCoT引物扩增的位点总数、多态性位点数、多态性位点百分率。利用NTSYS软件,计算猕猴桃种质间遗传相似系数,基于遗传相似系数进行UPGMA(Unweighted pair group method analysis)聚类分析。

2 结果与分析

2.1 SCoT扩增多态性分析结果

如表3所示,8条SCoT引物对28份猕猴桃种质材料共扩增出75条带,平均每条引物扩增出9.4条。其中,位点多态性条带数为73条,平均每条引物扩增出9.1条多态性条带,位点多态性比率为97.3%,多态性范围在88.9%~100.0%,显示筛选的8条SCoT引物标记具有较高的多态性。图1为引物SCoT-14、SCoT-21和SCoT-31对28份猕猴桃材料的SCoT标记多态性扩增图谱。从扩增结果来看,SCoT引物的扩增产物片段大小主要分布在250~2 000 bp,不同引物在同一种质材料中产生的位点信息存在差异,相同引物在不同种质材料中的位点信息也存在差异,显示供试的猕猴桃种质材料在基因组DNA水平上具有明显的差异。

表3 SCoT引物的扩增多态性信息Tab.3 Amplification polymorphic information of SCoT primers

图1 引物SCoT-14、SCoT-21和SCoT-31对28份猕猴桃种质的PCR扩增图谱Fig.1 PCR amplification fingerprint of 28 Actinidia germplasms with primer SCoT-14,SCoT-21,SCoT-31

2.2 猕猴桃种质遗传多样性分析结果

28份猕猴桃种质资源的遗传相似系数在0.47~0.86,平均值为0.59,变幅为0.39,显示供试的28份猕猴桃样本遗传多样性较为丰富(表4)。其中,美味猕猴桃实生2号与实生3号、中华猕猴桃华光2号与美味猕猴桃实生2号的遗传相似系数均为0.47,显示它们之间的亲缘关系较远。而美味猕猴桃陈阳与日本国立10号的遗传相似系数为0.86,表明它们之间的亲缘关系较近。

2.3 猕猴桃种质聚类分析结果

如图2所示,在遗传相似系数0.64处可将28份猕猴桃样本划分为3个明显的聚类分支。聚类群Ⅰ包含18个美味猕猴桃品种、4个中华猕猴桃品种以及2个软枣猕猴桃[软枣猕猴桃(雌)和软枣猕猴桃(雄)]。聚类群Ⅱ包含2个中华猕猴桃品种华光2号和华光3号,以及1个大籽猕猴桃,显示这2个中华猕猴桃品种的遗传变异较明显。聚类群Ⅲ包含1个美味猕猴桃品种实生2号,显示该株系在进化上较为独立。在遗传相似系数0.70处,聚类群Ⅰ可分为Ia、Ib、Ic、Id、Ie 5个亚分支。其中,Ia分支包含2个美味猕猴桃;Ib分支包含米坪行上2号和二郎坪栗坪1号2个美味猕猴桃,以及双龙1号和武宁魁2个中华猕猴桃;Ic分支包含13个美味猕猴桃,如实生3号、陈阳、秦香、米良1号、通渠1号、贵蜜、长安1号、徐洲75-2、北京215、金魁、日本国立10号、艾博特、海沃德2-3,以及1个中华猕猴桃通山5号;在Id分支,美味猕猴桃寨根3号与软枣猕猴桃(雌)和软枣猕猴桃(雄)聚类。聚类群Ⅰ的聚类关系表明,美味猕猴桃与中华猕猴桃以及软枣猕猴桃具有较近的亲缘关系。

图2 基于SCoT标记的28份猕猴桃种质UPGMA系统聚类结果Fig.2 UPGMA dendrogram of 28 Actinidia germplasms based on SCoT markers

3 结论与讨论

与其他分子标记相比,SCoT标记为研究者提供了一种能够有效跟踪性状并获得与性状相关目的基因的新型分子标记[15]。本研究对SCoT-PCR反应体系和扩增程序进行优化,并从55条SCoT引物中最终筛选出8条用于猕猴桃种质资源鉴定和遗传多样性分析。结果发现,平均每条SCoT引物扩增出9.4个位点,位点多态性比率达97.3%,显示了较好的扩增效果。28份猕猴桃材料的遗传相似系数在0.47~0.86,平均值为0.59,变幅为0.39,表明供试的猕猴桃种质间遗传差异较大,存在较丰富的遗传多样性,猕猴桃种内遗传相似性较高,种间遗传相似性较低。

表4 基于SCoT标记的28份猕猴桃种质资源的遗传相似系数Tab.4 Genetic similarity coefficient of 28 Actinidia germplasm resources based on SCoT markers

本研究猕猴桃种质聚类关系分析显示,28份猕猴桃种质资源在遗传相似系数为0.64水平处被划分为3个明显的聚类群,在聚类群Ⅰ中,中华猕猴桃与美味猕猴桃种质聚类,表明中华猕猴桃与美味猕猴桃具有较高的遗传相似性,种质亲缘关系较近,遗传关系复杂,推测中华猕猴桃与美味猕猴桃在种群进化中发生了基因渐渗或杂交,该结论与传统形态分类学和分子标记技术研究结论一致,进一步论证了美味猕猴桃可能作为中华猕猴桃的硬毛品种[2,16-18]。此外,2个软枣猕猴桃与美味猕猴桃和中华猕猴桃聚类在类群Ⅰ中,显示三者的遗传关系复杂,可能有共同的父系祖先,与基于叶绿体cpDNA的系统发育分析结论基本一致[19]。在聚类群Ⅱ中,2个中华猕猴桃品种华光2号和华光3号与1个大籽猕猴桃聚类,显示部分中华猕猴桃遗传变异水平较高,种质进化较为明显,中华猕猴桃与大籽猕猴桃有较近的遗传关系。

本研究基于SCoT分子标记的猕猴桃种质资源多样性分析表明,猕猴桃种质资源间具有丰富的遗传多样性,美味猕猴桃和中华猕猴桃具有相对较近的亲缘关系,种质群体间可能发生了基因渐渗和杂交,种间存在较近的亲本起源和进化。SCoT分子标记可有效用于猕猴桃种质资源的鉴定和遗传多样性研究,为猕猴桃品种改良和新品种选育提供理论支持,为伏牛山野生猕猴桃种质资源保护和利用提供参考。

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